王利

咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧 437100

尾加壓素Ⅱ?qū)θ槭笮募〕衫w維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究

王利

咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧 437100

目的 探討UⅡ誘導(dǎo)的CFs細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及細(xì)胞增殖與膠原合成的影響。 方法 體外培養(yǎng)CFs，采用免疫組織化學(xué)染色法及羥脯氨酸進行測定。 結(jié)果CFs培養(yǎng)上清中羥脯氨酸含量隨著UⅡ濃度的增加而先增后減，各組別羥脯氨酸含量均高于基礎(chǔ)狀態(tài)組，而低于10-8組羥脯氨酸含量。 結(jié)論UⅡ可促進CFs分泌膠原及增殖作用，可能是通過PKC/MAPK/CaN途徑實現(xiàn)其作用的。

尾加壓素Ⅱ；心??；成纖維細(xì)胞；膠原合成

尾加壓素Ⅱ（UⅡ）是目前發(fā)現(xiàn)的收縮血管活性最強的物質(zhì)。UⅡ及其受體在中樞神經(jīng)和心血管系統(tǒng)中廣泛的分布，對于心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有著重大的作用。筆者采用體外培養(yǎng)CFs，再采用免疫組織化學(xué)染色法及羥脯氨酸測定進行研究，為分子水平及細(xì)胞上為心肌纖維化的產(chǎn)生提供有利依據(jù)，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取出生1～3d的SD乳鼠，由中山醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為天津灝洋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Rat UⅡ、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色劑為武漢博士德公司產(chǎn)品。 DMEM、Che、PD98059、CsA、p-ERK1/2 為 Sigma產(chǎn)品。

1.2 方法

在無菌環(huán)境下取2～3d的SD仔鼠心室，采用差速貼壁法將采集細(xì)胞分離純化CFs。SABC法免疫組化染色，陽性即為纖維粘連蛋白染色，期培養(yǎng)的細(xì)胞為CFs可由結(jié)蛋白染色陰性和血管平滑肌肌動蛋白Ⅷ因子來證明。CFs培養(yǎng)上清中的膠原含量檢測，采取羥脯胺基酸比色法進行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)處理對數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行，采用χ2檢驗計量資料，采用（±s）檢驗計量型數(shù)據(jù)，以 P＜0.05，為有顯著差異性，提示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

①由表1可見，CFs培養(yǎng)上清中羥脯氨酸含量隨著UⅡ濃度的增加而先增后減，10-7組與基礎(chǔ)狀態(tài)組比較無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），其余各組與基礎(chǔ)狀態(tài)組比較，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 不同濃度的UⅡ?qū)Fs培養(yǎng)上清中膠原含量的影響（±s）

表1 不同濃度的UⅡ?qū)Fs培養(yǎng)上清中膠原含量的影響（±s）

UⅡ(mol/L) 羥脯氨酸（μg/mg protein）10-10組10-9組10-8組10-7組基礎(chǔ)狀態(tài)組3.89±0.31 4.35±0.44 8.26±0.28 2.62±0.35 2.48±0.34

②由表2可見，各組別羥脯氨酸含量均高于基礎(chǔ)狀態(tài)組，而低于10～8組羥脯氨酸含量，相互比較，P＜0.05，均有統(tǒng)計學(xué)意義。

③由表 3 可見，PD98059（10-5mol/L）+UⅡ（10-8mol/L）與 10-8組P-ERK1/2灰度比較，P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。其他各組相互比較，P＜0.05，均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 che、PD98059與CsA誘導(dǎo)的UⅡ?qū)Fs培養(yǎng)上清中膠原含量的影響（±s）

表2 che、PD98059與CsA誘導(dǎo)的UⅡ?qū)Fs培養(yǎng)上清中膠原含量的影響（±s）

組別 羥脯氨酸（μg/mg protein）Che（10-6mol/L）+UⅡ（10-8mol/L）PD98059（10-5mol/L）+UⅡ（10-8mol/L）CsA（5μg/mL）+UⅡ（10-8mol/L）基礎(chǔ)狀態(tài)組4.22±0.23 3.68±0.52 4.16±0.53 2.48±0.34

表4 che、PD98059與CsA對UⅡ誘導(dǎo)的CFsp-ERK1/2灰度的影響（±s）

表4 che、PD98059與CsA對UⅡ誘導(dǎo)的CFsp-ERK1/2灰度的影響（±s）

組別 p-ERK1/2灰度Che（10-6mol/L）+UⅡ（10-8mol/L）PD98059（10-5mol/L）+UⅡ（10-8mol/L）CsA（5μg/mL）+UⅡ（10-8mol/L）基礎(chǔ)狀態(tài)組186.33±5.68 159.21±2.11 185.46±4.78 202.99±4.68

3 討論

CFs是主要合成與分泌心臟細(xì)胞外基質(zhì)及心臟中數(shù)量最多的細(xì)胞類型，左心室肥厚的主要病理基礎(chǔ)可能是沉積造成心肌纖維化、CFs的增殖與膠原合成的增多。本組UⅡ具有促進CFs增殖及膠原合成的作用，在10-7UⅡ組，CFs培養(yǎng)上清中的p-ERK1/2灰度及膠原含量與基礎(chǔ)狀態(tài)比較，無統(tǒng)計學(xué)意義，說明UⅡ促CFs增殖與膠原合成作用隨著UⅡ濃度的增加而減弱。

UⅡ是一種促動脈平滑肌細(xì)胞增生的內(nèi)源性絲裂原，該效應(yīng)可能通過PKC、Ca離子、鈣調(diào)素依賴的CaM-PK和MAPK來介導(dǎo)，且UⅡ作用于血管平滑肌細(xì)胞后，可由刺激黏著FAK的活化來促進細(xì)胞增殖，該作用與PKC介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有密切關(guān)系[4]。本組che、PD98059與CsA誘導(dǎo)的UⅡ?qū)Fs細(xì)胞增殖與膠原合成有抑制效應(yīng)，說明可能通過PKC/MAPK/CaN途徑實現(xiàn)UⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成作用機制，PD98059對UⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖無抑制作用，說明可能由改變p-ERK的表達PKC與CaN通路來完成增值效應(yīng)，PKC與CaN交叉后可形成共同通路，而使p-ERK1/2表達發(fā)生改變。綜上所訴，UⅡ可促進CFs分泌膠原及增殖作用，可能是通過PKC/MAPK/CaN途徑實現(xiàn)其作用的。

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A

1672-5654（2012）07（a）-0046-01

2012-06-15）