王 玲 單保恩 張海譜 王 彬 (河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所，河北 石家莊 0500)

研究顯示，抗炎藥物塞來昔布可以抑制多種乳腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可以在一定程度抑制乳腺癌的發(fā)展〔1〕。學(xué)者們推測(cè)鑒于塞來昔布毒性低、安全性較高，將有可能成為乳腺癌長(zhǎng)期治療的輔助藥物。MDA-MB-231細(xì)胞是一種雌、孕激素受體均為陰性的乳腺癌細(xì)胞，而這種亞型的乳腺癌正是目前乳腺癌中治療效果差、易發(fā)生化療耐藥的亞型。我室前期的研究資料顯示，NF-κB信號(hào)通路在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能，直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡及侵襲行為〔2，3〕。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立人 MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，構(gòu)建靶向沉默NF-κB p65基因的miRNA，研究塞來昔布和p65miRNA對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及其聯(lián)合應(yīng)用可能產(chǎn)生的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 塞來昔布購自美國輝瑞制藥有限公司。胎牛血清購自杭州四季青公司。Trizol試劑、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、Opti-MEM?I無血清培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，引物合成由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。蛋白抽提及定量試劑盒購自美國Pierce公司。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。兔抗人p65，鼠抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP-2)及GAPDH抗體均購自Santa Cruz公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。48只4～5周齡BALB/c(nu/nu)裸小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(18.95±0.85)g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。裸鼠均在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)條件下分籠飼養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫上海保藏中心。用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)的 DMEM 完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)呈70% ～80%融合狀態(tài)時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每3～4天傳代一次。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒p65miRNA設(shè)計(jì)、合成及轉(zhuǎn)染 根據(jù)人p65基因序列〔NM_021975〕，委托Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成4對(duì)長(zhǎng)度為21nt的序列。與線性表達(dá)質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR合成環(huán)形的重組質(zhì)粒。構(gòu)建了4個(gè)針對(duì)靶位點(diǎn)的質(zhì)粒表達(dá)載體，即pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-p65-1(p65miRNA-1)、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-p65-2(p65miRNA-2)、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-p65-3 (p65miRNA-3)、pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-p65-4(p65miRNA-4)和陰性對(duì)照載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-Negtive(Neg-miRNA)。經(jīng)體外相關(guān)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，p65miRNA-1、p65miRNA-2、p65miRNA-3的沉默效果均較好，故我們選取其中一個(gè)質(zhì)粒p65miRNA-1(p65miRNA)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4 乳腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 實(shí)驗(yàn)前于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)1 w，觀察裸小鼠的生長(zhǎng)情況、無菌飼料及飲水，晝夜交替各12 h，環(huán)境溫度適宜，SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。取5×106個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞在裸鼠腋下進(jìn)行皮下組織內(nèi)注射。注射后裸鼠繼續(xù)置于層流罩內(nèi)飼養(yǎng)。待腫瘤平均直徑生長(zhǎng)至約5 mm時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組：(A)control組：瘤內(nèi)多點(diǎn)注射100 μl PBS和灌胃 100 μl 0.9% 氯化鈉溶液;(B)Neg-miRNA質(zhì)粒組：瘤內(nèi)多點(diǎn)注射100 μl Neg-miRNA質(zhì)粒和灌胃100 μl 0.9%氯化鈉溶液;(C)p65miRNA組：瘤內(nèi)多點(diǎn)注射100 μl p65miRNA質(zhì)粒和灌胃100 μl 0.9%氯化鈉溶液;(D)塞來昔布組：瘤內(nèi)多點(diǎn)注射100 μl PBS和灌胃100 μl塞來昔布溶液;(E)塞來昔布+Neg-miRNA組：瘤內(nèi)多點(diǎn)注射100 μl Neg-miRNA質(zhì)粒和灌胃 100 μl塞來昔布溶液;(F)塞來昔布 +p65miRNA組：瘤內(nèi)多點(diǎn)注射100 μl p65miRNA質(zhì)粒和灌胃100 μl塞來昔布溶液。塞來昔布劑量為 50 mg·kg－1·d－1，每天1次，0.9%氯化鈉溶液等體積作為空白對(duì)照。質(zhì)粒均采用瘤內(nèi)注射的方法，20 μg/只(注射前將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑以1∶3的比例充分混合，以提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率)，注射容積為100 μl，等體積PBS作為空白對(duì)照，每周1次。

1.5 荷瘤動(dòng)物生存狀況的觀察 定期觀察裸小鼠精神、飲食及排便等情況，測(cè)量腫瘤體積平均值，繪制各組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。至42 d時(shí)，處死各組裸鼠，計(jì)算抑瘤率。

1.6 免疫組化法檢測(cè)p65的表達(dá) 腫瘤組織經(jīng)10%甲醛固定后，石蠟包埋，免疫組織化學(xué)染色采用SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復(fù)，分別滴加一抗和二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)VEGF、MMP-2 mRNA的表達(dá) 從液氮中取出保存的各組裸鼠移植瘤組織，提取總RNA，每100 mg腫瘤組織加入1 ml Trizol試劑，勻漿，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，各取1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，取2 μl cDNA 以 VEGF、MMP-2和β-actin的引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為 25 μl。

1.8 Western印跡法檢測(cè)VEGF、MMP-2蛋白的表達(dá) 從液氮中取出保存的裸鼠移植瘤組織，每個(gè)樣本100 mg，置入勻漿器中，粉碎并研磨至粉末，再轉(zhuǎn)入離心管中，按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行蛋白提取及定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間比較采用χ2、t檢驗(yàn)和方差分析。

表1 VEGF、MMP-2、β-actin 的引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 塞來昔布聯(lián)合p65miRNA對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 各組裸鼠接種MDA-MB-231細(xì)胞7 d后均可見皮下腫瘤形成，且腫瘤生長(zhǎng)很迅速，成瘤率高達(dá)100%，各組裸鼠之間移植瘤體積無明顯差異，裸鼠的精神、活動(dòng)、飲食及糞便均無異常。待腫瘤生長(zhǎng)至平均直徑為5 mm時(shí)，隨機(jī)將動(dòng)物分組進(jìn)行干預(yù)。塞來昔布組、p65miRNA組以及塞來昔布+p65miRNA組的裸鼠移植瘤生長(zhǎng)明顯延遲，其他組的移植瘤生長(zhǎng)仍然很旺盛。至第6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，C、D、E、F實(shí)驗(yàn)組裸鼠的移植瘤體積明顯小于其他組，A、B組裸鼠的平均瘤體體積近約為實(shí)驗(yàn)組的2倍，但A、B組之間瘤體體積無明顯差別(圖1)。實(shí)驗(yàn)C～F組腫瘤平均瘤重與對(duì)照組相比明顯減輕，其中F組效果最為明顯。C、D、E、F組抑瘤率分別為40.72%、43.23%、44.42%、61.69%。

2.2 p65miRNA對(duì)裸鼠移植瘤p65蛋白表達(dá)的影響 NegmiRNA對(duì)照組裸鼠皮下移植瘤組織標(biāo)本中可見p65主要位于腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)，也可見于少數(shù)細(xì)胞核中，陽性率高達(dá)79.63%。而p65miRNA質(zhì)粒處理組裸鼠皮下移植瘤中，細(xì)胞漿的黃色明顯變淺、減弱，陽性率為23.17%，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)(圖2)。說明p65miRNA抑制p65蛋白表達(dá)。

圖1 各組MDA-MB-231乳腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線

2.3 RT-PCR法檢測(cè)VEGF、MMP-2 mRNA表達(dá)的變化 F組裸鼠腫瘤組織的VEGF mRNA條帶顏色淺、很弱。C～F治療組裸鼠腫瘤組織的MMP-2 mRNA相對(duì)于A、B對(duì)照組來說，條帶明顯減弱，尤其是F組效果最顯著(圖3)。

2.4 Western印跡法檢測(cè)VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)的變化 F治療組裸鼠腫瘤組織的VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)被強(qiáng)烈抑制，條帶很弱。C、D、E治療組裸鼠腫瘤組織的VEGF、MMP-2蛋白條帶變窄、顏色變淺，提示C～E組VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)受到了不同程度的抑制(圖4)。

圖2 乳腺癌裸鼠移植瘤組織中p65的表達(dá)(×400)

圖3 各組MDA-MB-231乳腺癌裸鼠移植瘤組織中VEGF、MMP-2 mRNA的表達(dá)

圖4 各組MDA-MB-231乳腺癌裸鼠移植瘤組織中VEGF、MMP-2蛋白的表達(dá)

3 討論

研究調(diào)查顯示預(yù)防性服用塞來昔布不僅可以降低乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)〔4〕，而且還可以在一定程度上抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔5〕。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn) celecoxib在25～100 mg·kg－1·d－1劑量范圍內(nèi)對(duì)乳腺癌移植瘤具有很好的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)我們選取50 mg·kg－1·d－1塞來昔布常規(guī)治療荷瘤小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)塞來昔布可以延緩和抑制腫瘤的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為接種后14 d起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束腫瘤生長(zhǎng)速度、體積均小于對(duì)照組。

NF-κB是一組重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要而且復(fù)雜的作用，NF-κB通路的異常激活可導(dǎo)致一系列與腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移等，直接影響惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔6〕。p65是NF-κB復(fù)合體中負(fù)責(zé)由胞外向核內(nèi)的傳遞信息的快反應(yīng)因子，是NF-κB信號(hào)通路中的樞紐，可以啟動(dòng)多種生命活動(dòng)進(jìn)程〔7〕。我室的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MDA-MB-231細(xì)胞中NF-κB異常高度活化，并與該細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在體外靶向沉默p65基因可以顯著地誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的侵襲遷移。由于體內(nèi)生理環(huán)境的復(fù)雜性，體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能代替體內(nèi)的現(xiàn)象，為此有必要開展體內(nèi)研究，為臨床治療提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為了驗(yàn)證體內(nèi)采用的轉(zhuǎn)染試劑是否可使該質(zhì)粒有效抑制腫瘤中的p65表達(dá)水平，我們采用免疫組化進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，p65miRNA組相對(duì)陰性對(duì)照組而言，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中棕黃色顆粒明顯減少，p65陽性表達(dá)率受到了顯著地抑制。p65miRNA質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染后表達(dá)的作用時(shí)間一般為1 w以上，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)于荷瘤裸鼠的治療采用的是多點(diǎn)瘤內(nèi)注射，1次/w，連續(xù)4次，因此可以確保所轉(zhuǎn)染的miRNA質(zhì)粒的作用時(shí)間為30 d左右。

塞來昔布聯(lián)合p65miRNA具有一定地協(xié)同作用，且可以顯著降低腫瘤組織中VEGF和MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平，而塞來昔布單獨(dú)治療組或p65miRNA干預(yù)組對(duì)于這兩個(gè)基因的表達(dá)雖有不同程度的影響，但效果遠(yuǎn)不如聯(lián)合治療組。VEGF是主要血管新生因子，參與腫瘤血管新生的全過程，成為抗血管新生的重要靶標(biāo)〔8〕。塞來昔布不僅可以通過抑制VEGF降低多種腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力，而且VEGF的啟動(dòng)子區(qū)還可以接受p65基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，p65miRNA在一定程度上可以減少VEGF的表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合治療后VEGF mRNA和蛋白水平較其他各組均顯著下降，提示塞來昔布與p65miRNA可以有效地調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤新生血管的形成能力。MMPs是一種鋅離子依賴性蛋白內(nèi)切酶，腫瘤的侵襲多是因?yàn)镸MPs與其天然特異性抑制劑TIMP調(diào)節(jié)失控的結(jié)果〔9〕。我室前期研究結(jié)果顯示，體外應(yīng)用塞來昔布、p65miRNA均可以降低MDA-MB-231分泌MMP-2的能力。本實(shí)驗(yàn)通過在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了塞來昔布、p65miRNA對(duì)于移植瘤中MMP-2基因表達(dá)的影響。提示兩者聯(lián)合治療可從轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞酶的表達(dá)，防止過量MMP集聚在細(xì)胞周圍，阻斷腫瘤細(xì)胞為其自身轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示體內(nèi)沉默p65基因與塞來昔布聯(lián)合應(yīng)用展示了良好協(xié)同作用，COX-2抑制劑與基因治療的聯(lián)合應(yīng)用將可望降低臨床化療藥物劑量而達(dá)到相同的療效，為臨床應(yīng)用塞來昔布防治乳腺癌提供了部分理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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