韓俊萍，李彩霞，嚴(yán) 紅，朱 典，李艮平，胡 蘭

（1.中國(guó)人民公安大學(xué)，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；4.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

低體積PCR擴(kuò)增用于單細(xì)胞分離和檢驗(yàn)

韓俊萍1，李彩霞2，3，嚴(yán) 紅2，朱 典4，李艮平4，胡 蘭2，3

（1.中國(guó)人民公安大學(xué)，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；4.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016）

目的 優(yōu)化在單細(xì)胞分離檢驗(yàn)中應(yīng)用0.2mL試管做低體積擴(kuò)增載體的最佳反應(yīng)條件。 方法 制備理想口腔上皮細(xì)胞懸液，用0.2mL試管分別收集捕獲到的5、10個(gè)細(xì)胞，設(shè)置蛋白酶K添加、PCR反應(yīng)金牌酶用量、循環(huán)次數(shù)3組條件，用Identifiler?Plus試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，比較各組的檢出率、等位基因丟失率和非特異性擴(kuò)增情況。 結(jié)果 用0.2mL試管做低體積擴(kuò)增中，加蛋白酶K裂解、PCR反應(yīng)金牌酶0.4μL、PCR反應(yīng)32個(gè)循環(huán)，這3個(gè)條件的檢出率較高，等位基因丟失率較低。 結(jié)論 在單細(xì)胞分離檢驗(yàn)中采用0.2mL試管進(jìn)行低體積擴(kuò)增，可以作為芯片-低體積擴(kuò)增的有效補(bǔ)充手段。

法醫(yī)遺傳學(xué)；核酸擴(kuò)增技術(shù)；單細(xì)胞

混合生物檢材的DNA分型問(wèn)題是法醫(yī)實(shí)際檢案的難題之一，而近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的單細(xì)胞分離檢驗(yàn)技術(shù)[1]是實(shí)現(xiàn)混合樣品分離檢驗(yàn)的有效方法之一。有研究建立了單細(xì)胞分離檢驗(yàn)技術(shù)，其中的芯片-低體積擴(kuò)增技術(shù)使整個(gè)平臺(tái)的靈敏度顯著提高[2-6]。但在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，低體積擴(kuò)增技術(shù)使用的擴(kuò)增玻片采用開(kāi)放設(shè)計(jì)的模式，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作的要求較高，并且需要單獨(dú)購(gòu)置擴(kuò)增儀器，增加了成本，不利于該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。因此，本研究旨在探索試管中進(jìn)行低體積擴(kuò)增的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

理想口腔拭子（健康志愿者提供）1枚。

Identifier?Plus試劑盒（含Control DNA 9947A）、9700型熱循環(huán)儀、3130型遺傳分析儀均購(gòu)自美國(guó)AB公司，Olympus倒置顯微鏡、TransferMan NK2顯微操作儀、80 μm毛細(xì)管玻璃吸針均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞懸液的制備

取1枚口腔拭子放入加有1mL無(wú)菌去離子水的1.5mL試管中，晃動(dòng)拭子幾次，使其上的細(xì)胞充分脫落，棄去拭子，振蕩離心管，混勻液體。

1.2.2 細(xì)胞捕獲

參照文獻(xiàn)[4]顯微捕獲操作步驟進(jìn)行細(xì)胞捕獲。

1.2.3 考察蛋白酶K的作用

取2組0.2mL試管，每組16個(gè)。第一組每管加1.2μL的滅菌水，第二組每管加1.2μL的蛋白酶K（質(zhì)量濃度為0.4mg/mL），每組均加入捕獲的細(xì)胞5、10個(gè)，各8管，以離心半徑5 cm，8 000 r/min，離心1 min，加入3.5μL礦物油。將第二組放于9700型熱循環(huán)儀在56℃ 1h、99℃ 10min條件下裂解變性。第一組不裂解。之后，2組各管均加1.2μL PCR反應(yīng)液（含金牌酶0.4μL），用Identifiler?Plus試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 11min；94℃ 20s，59℃ 3min，30個(gè)循環(huán)；60℃延伸40min；4℃保存。所有產(chǎn)物均在3130型遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)。每組均設(shè)有陰性和9947A陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 PCR反應(yīng)金牌酶用量的優(yōu)化

取2組0.2mL試管，每組16個(gè)，每組均加入捕獲的細(xì)胞5、10個(gè)，各8管，加1.2μL蛋白酶K裂解，再加1.2μL PCR反應(yīng)液，其中第一組含金牌酶0.2μL，第二組含金牌酶0.4μL，擴(kuò)增程序及其他步驟均同上。

1.2.5 PCR循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

取3組0.2 mL試管，每組16個(gè)，每組均加入捕獲的細(xì)胞5、10個(gè)，各8管，加1.2μL蛋白酶K裂解，再加1.2 μL PCR反應(yīng)液（含金牌酶0.4 μL），第一組擴(kuò)增時(shí)循環(huán)30次，第二組循環(huán)32次，第三組循環(huán)34次，其他步驟均同上。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所得DNA檢測(cè)圖譜均與已知分型結(jié)果比對(duì)，獲得13個(gè)基因座以上正確分型且各等位基因峰高大于50RFU為有效分型結(jié)果。每個(gè)條件下的8次實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照同一基因座出現(xiàn)該峰5次以上的原則進(jìn)行結(jié)果綜合，綜合結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)分型比對(duì)。所得數(shù)據(jù)采用四格表χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白酶K對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在細(xì)胞數(shù)目相同的情況下，添加蛋白酶K的檢出率（有效分型次數(shù)/8次實(shí)驗(yàn)）、非特異性擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)（出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的位點(diǎn)/16個(gè)位點(diǎn)×8次實(shí)驗(yàn)）、等位基因丟失率（等位基因丟失條帶總數(shù)/預(yù)計(jì)等位基因總條帶）結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，添加蛋白酶K的檢出率高于不加蛋白酶K，等位基因丟失率也低于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5個(gè)和10個(gè)細(xì)胞的綜合結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)分型一致。

表1 是否加蛋白酶K的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=8，%）

2.2 PCR反應(yīng)中金牌酶用量的優(yōu)化

當(dāng)細(xì)胞數(shù)目相同時(shí)，PCR反應(yīng)中金牌酶加0.4μL的非特異性擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)和等位基因丟失率均低于加0.2μL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組的綜合結(jié)果均與標(biāo)準(zhǔn)分型一致。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 PCR反應(yīng)中金牌酶不同用量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=8，%）

2.3 對(duì)PCR循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

當(dāng)細(xì)胞數(shù)目相同時(shí)，3組循環(huán)數(shù)的等位基因丟失率比較，PCR循環(huán)32次等位基因丟失率明顯低于循環(huán)次數(shù)為30和34，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組的綜合結(jié)果均與標(biāo)準(zhǔn)分型一致。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 循環(huán)次數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=8，%）

2.4 不同細(xì)胞數(shù)的檢出率和等位基因丟失率的比較

在加入蛋白酶K、PCR反應(yīng)加金牌酶0.4 μL、循環(huán)次數(shù)為32的條件下，5個(gè)細(xì)胞的檢出率是75%，等位基因丟失率12.05%，10個(gè)細(xì)胞可以獲得穩(wěn)定的完整分型，二者等位基因丟失率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)使用顯微操作方法捕獲所需數(shù)目的口腔上皮細(xì)胞，置于0.2 mL試管中，裂解時(shí)在管中加入3.5μL礦物油封閉，以防止因溫度過(guò)高蛋白酶K蒸發(fā)導(dǎo)致裂解不完全，同時(shí)也有效避免了DNA量的損失。實(shí)驗(yàn)中除嚴(yán)格控制污染外，同時(shí)設(shè)置陰性和9947A陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果均顯示正確，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)未受到外源性DNA的污染。

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，加蛋白酶K裂解的實(shí)驗(yàn)組要優(yōu)于不加蛋白酶K，而且增加PCR反應(yīng)液中金牌酶量以及循環(huán)次數(shù)，減少了等位基因丟失，提高檢測(cè)靈敏度。但當(dāng)循環(huán)數(shù)增加至34次時(shí)，非特異性擴(kuò)增增加同時(shí)等位基因丟失增多，這是由于循環(huán)數(shù)增多，小片段優(yōu)先擴(kuò)增，大片段的擴(kuò)增產(chǎn)物少，使得等位基因丟失反而增多，故循環(huán)數(shù)不是越多越好。常規(guī)的PCR反應(yīng)體系中金牌酶加0.2 μL，本實(shí)驗(yàn)中增加至0.4μL，其作用是在小體系下酶量加倍可以增大反應(yīng)效率，減少等位基因片段的丟失。綜合以上3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化出2μL體系擴(kuò)增條件為加蛋白酶K裂解，循環(huán)32次，反應(yīng)液中金牌酶量加0.4μL。

在優(yōu)化出的實(shí)驗(yàn)條件下，10個(gè)細(xì)胞的檢出率達(dá)100%，等位基因丟失率明顯低于5細(xì)胞，雖然5個(gè)細(xì)胞的檢出率達(dá)不到100%，但是綜合8次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果最終可以獲得完整的分型，因此，用試管做2 μL擴(kuò)增，其靈敏度也較高，能滿足微量檢材擴(kuò)增的要求。

前期研究表明，使用顯微操作技術(shù)聯(lián)合AmpliGrid芯片-低體積擴(kuò)增進(jìn)行單細(xì)胞分離檢驗(yàn)，3個(gè)口腔上皮細(xì)胞就能得到完整的Identifiler和Minifiler這兩種試劑盒的分型圖譜[4-5]。AmpliGrid 1 μL體系顯著提高了檢測(cè)的靈敏度和檢出率，對(duì)研究微量和超微量檢材具有重要意義。但其也存在一些不足，首先AmpliGrid微量反應(yīng)玻片價(jià)格昂貴，增加了檢測(cè)成本；其次，該玻片48個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)是開(kāi)放性的，如果一次實(shí)驗(yàn)未用完，第二次使用時(shí)存在污染的可能，對(duì)低體積擴(kuò)增影響很大；再次，玻片上由于操作技術(shù)或其他原因在裂解和擴(kuò)增時(shí)容易產(chǎn)生氣泡爆掉，最終得不到任何實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即穩(wěn)定性不太好?；谏鲜霾蛔?，本研究?jī)?yōu)化了試管作為2μL擴(kuò)增體系。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該體系的靈敏度和檢出率雖然不如用芯片做低體積擴(kuò)增體系高，但是其成本遠(yuǎn)低于1μL體系，不需要額外購(gòu)置擴(kuò)增儀器，對(duì)操作技巧要求低，可以作為低體積擴(kuò)增技術(shù)的有效補(bǔ)充手段之一。

[1]Findlay I，Taylor A，Quirke P，et al.DNA fingerprinting from single cells[J].Nature，1997，389（6651）：555-556.

[2]張健，胡蘭，張惠芹，等.利用LCM技術(shù)從生物檢材中提取單個(gè)細(xì)胞[J].中國(guó)人民公安大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，（1）：14-17.

[3]李鑫，胡蘭，郭紅玲，等.顯微操作法提取混合斑中精子細(xì)胞方法的探討[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（5）：263-265.

[4]亓冰，李彩霞，涂政，等.單細(xì)胞顯微捕獲技術(shù)聯(lián)合LVPCR系統(tǒng)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2009，32（2）：84-88.

[5]蘇芹，嚴(yán)紅，李彩霞，等.MiniFiler試劑盒進(jìn)行微量細(xì)胞STR分型可行性探討[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（5）：330-332.

[6]黃江平，李彩霞，亓冰，等.顯微捕獲技術(shù)結(jié)合低體積擴(kuò)增技術(shù)在混合唾液斑檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].吉林公安高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2010，（1）：49-54.

2011-12-05）

（本文編輯：李成濤）

Low Volume Amplification in Single Cell Separation and Inspection

HAN Jun-ping1,LI Cai-xia2,3,YAN Hong2,ZHU Dian4,LI Gen-ping4,HU Lan2,3
（1.Chinese People’s Public Security University,Beijing 100038,China;2.Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security,P.R.China,Beijing 100038,China;3.Key laboratory of Forensic Genetics,Ministry of Public Security,Beijing 100038,China;4.Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China）

Objective To establish optimal amplification conditions with the application of 0.2mL test tube in single cell separation and inspection.Methods Oral epithelium cell suspension was prepared.Five or ten cells were collected with 0.2 mL test tube.Then DNA were amplified with Identifiler?Plus kit in three different conditions in which the proteinase K addition,gold enzyme concentration in PCR reaction, and PCR reaction cycles were adjusted separately.Finally the detection rate,allelic dropout rate and artificial alleles were compared among the groups.Results In these 3 different conditions：addition of proteinase K,addition of 0.4 μL gold enzyme in PCR reaction,and use of 32 cycles,the detection rate was higher and allelic dropout rate was lower than the other conditions.Conclusion In single cell separation and inspection,the usage of 0.2mL test tube could be an effective supplement to chip-low volume amplification.

forensic genetics;nucleic acid amplification techniques;single cell

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.012

1004-5619（2012）02-0123-03

韓俊萍（1986—），女，山西太原人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：pgww19861025@163.com

胡蘭，女，博士，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：hulan328@yahoo.com