張 萍，馬開軍，張 恒，王慧君，沈憶文，陳 龍

（1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200043；3.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 201102）

實(shí)時(shí)RT-PCR常用內(nèi)對(duì)照在死亡早期人心肌內(nèi)的穩(wěn)定性

張 萍1，馬開軍2，張 恒1，王慧君3，沈憶文1，陳 龍1

（1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200043；3.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 201102）

目的 探討實(shí)時(shí)RT-PCR方法常用內(nèi)對(duì)照表達(dá)水平在死亡早期人體心肌組織中的穩(wěn)定性。 方法選取10例具有一致的外界環(huán)境（平均存放溫度25℃）、不同死亡時(shí)間（4.3～22.3h）的個(gè)體，提取心肌組織的總RNA。選擇6個(gè)常用內(nèi)對(duì)照：β-actin、GAPDH、B2M、U6、18S rRNA、HSA-miR-1，通過實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)其在心肌組織的表達(dá)水平。利用genormPLUS軟件評(píng)估內(nèi)對(duì)照在死亡早期表達(dá)水平的穩(wěn)定性，挑選出最穩(wěn)定的內(nèi)對(duì)照并且分析其表達(dá)水平與相關(guān)因素（年齡、性別、死因）的關(guān)系。 結(jié)果 死亡早期心肌組織中U6表達(dá)水平最穩(wěn)定，其表達(dá)量與年齡、性別及死因無關(guān)（P＞0.05）。 結(jié)論 U6可以作為實(shí)時(shí)RT-PCR方法研究死亡時(shí)間與心肌組織中核酸降解之間規(guī)律的理想內(nèi)對(duì)照。

法醫(yī)病理學(xué)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；心??；內(nèi)對(duì)照；死亡時(shí)間

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷是法醫(yī)學(xué)最重要的任務(wù)之一，準(zhǔn)確的死亡時(shí)間推斷，有利于迅速確定涉案罪犯以及排除嫌疑人[1-3]。傳統(tǒng)的死亡時(shí)間推斷方法主要根據(jù)尸體現(xiàn)象（如尸斑、尸冷、尸僵、角膜混濁等）[4]、胃內(nèi)容物的消化程度、蠅蛆的生長(zhǎng)規(guī)律[5-6]以及植物根系和苔蘚類生物的生長(zhǎng)變化[7]等，但這些方法都容易受到外界環(huán)境的干擾[1，8]。分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展為這一課題提供了新思路[9]，其中尸體樣本中的核酸分析技術(shù)的應(yīng)用，特別是通過實(shí)時(shí)RT-PCR的方法研究核酸降解規(guī)律與死亡時(shí)間之間的關(guān)系已成為研究的焦點(diǎn)[10-12]。

本實(shí)驗(yàn)選擇6個(gè)常用的內(nèi)對(duì)照，通過實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)對(duì)死亡早期心肌組織中各內(nèi)對(duì)照的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，分析內(nèi)對(duì)照在死亡早期的穩(wěn)定性，旨在為利用實(shí)時(shí)RT-PCR方法進(jìn)行早期死亡時(shí)間推斷提供準(zhǔn)確穩(wěn)定的內(nèi)對(duì)照。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNA later保護(hù)液（美國(guó)Ambion公司），TRIzol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司）。NanoDrop 1000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），PRISM 7500 Fast實(shí)時(shí)PCR System（美國(guó)AB公司），7500 System軟件v2.0.1（美國(guó)AB公司），GraphPad Prism v5.0軟件（美國(guó)Graphpad軟件公司），genormPLUS軟件（比利時(shí)Biogazelle公司）。

1.2 材料

選取10例上海市公安局物證鑒定中心檢案案例，尸體的外界環(huán)境相似（尸體均在室溫下存放和解剖，平均室溫25℃）且尸體沒有呈現(xiàn)肉眼可見的腐敗現(xiàn)象。每例尸體都有較準(zhǔn)確的記錄，包括死亡時(shí)間、死因等（表1）。取適量（50～100 mg）左心室肌肉組織分裝于RNA later保護(hù)液中，立即置于-80℃凍存。

表1 研究案例的詳細(xì)信息

1.3 內(nèi)對(duì)照的選擇

選擇β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、β2-微球蛋白（beta 2-microglobulin，B2M）、人U6微核RNA（human U6 small nuclear RNA，U6）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）和人血清白蛋白-微小RNA-1（human serum albumin-miR-1，HSA-miR-1）共6個(gè)內(nèi)對(duì)照。引物設(shè)計(jì)至少跨一個(gè)外顯子或外顯子區(qū)域以保證cDNA正確的合成與擴(kuò)增，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)選取的內(nèi)對(duì)照及引物序列

1.4 RNA的提取與cDNA的合成

取凍存組織（約50 mg），按照TRIzol試劑盒總RNA提取說明書操作步驟提取總 RNA，NanoDrop 1000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA提取質(zhì)量?？俁NA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用polyA加尾反應(yīng)[13]。

1.5 實(shí)時(shí)RT-PCR

應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)。按說明書配制20μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL、cDNA模板1μL、雙蒸滅菌水7.8 μL。應(yīng)用PRISM 7500 Fast實(shí)時(shí)PCR System進(jìn)行兩步法擴(kuò)增，條件如下：95℃30s預(yù)變性；95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)。經(jīng)7500 System軟件v2.0.1分析可得到樣本各內(nèi)對(duì)照的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用genormPLUS軟件將某一內(nèi)對(duì)照與其他內(nèi)對(duì)照表達(dá)水平的兩兩比值經(jīng)對(duì)數(shù)變換后，計(jì)算其平均標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值M。按照操作說明對(duì)6個(gè)內(nèi)對(duì)照的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用GraphPad Prism v5.0軟件進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)對(duì)照穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果

在本研究中所采用的內(nèi)對(duì)照的M值見表3。因?yàn)镸值越小，內(nèi)對(duì)照表達(dá)水平越穩(wěn)定，由表3可知，各內(nèi)對(duì)照的表達(dá)穩(wěn)定性由高到低排序依次為：U6＞18S rRNA＞HSA-miR-1＞B2M＞GAPDH＞β-actin，因此U6是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)對(duì)照。

表3 內(nèi)對(duì)照穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果

2.2 U6表達(dá)水平與性別、年齡、死因之間的關(guān)系

分別采用t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，分析U6與性別、年齡及死因之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在死亡早期U6的表達(dá)水平是穩(wěn)定的，U6在心肌組織中的表達(dá)量不受性別的影響，男性與女性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；U6的表達(dá)量與年齡之間無相關(guān)性（r=-0.3516，P＞0.05），排除了年齡因素對(duì)U6表達(dá)的影響；在失血性休克、心源性猝死與其他死因之間，U6的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。綜合分析，在死亡早期U6的含量不受性別、年齡與死因的影響。

3 討 論

死亡時(shí)間的推斷一直是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要且復(fù)雜的課題，其推斷方法多種多樣，但準(zhǔn)確性卻不盡相同。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)測(cè)定機(jī)體死后生物樣本中某種特異性RNA含量來推斷死亡時(shí)間已成為研究熱點(diǎn)[10-12]。實(shí)時(shí)RT-PCR方法在檢測(cè)基因表達(dá)水平方面與其他檢測(cè)方法相比具有很好的靈敏性與特異性[14]，與RT-PCR技術(shù)相比，具有方便、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，不僅可對(duì)擴(kuò)增后電泳條帶進(jìn)行分析，也可對(duì)擴(kuò)增的全過程加以監(jiān)測(cè)，利用循環(huán)閾值（Ct值）與起始模板濃度的對(duì)數(shù)呈反比關(guān)系來計(jì)算mRNA的表達(dá)水平。但其結(jié)果依賴于準(zhǔn)確的內(nèi)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化[15]。因此，對(duì)于死后的組織，找出合適的內(nèi)對(duì)照對(duì)于基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要。

Vandesompele等[16]于2002年編寫了geNorm程序，用于候選內(nèi)對(duì)照的穩(wěn)定性排序及找出合適的內(nèi)對(duì)照。genormPLUS是對(duì)geNorm的改良，作為內(nèi)對(duì)照選擇的良好工具，其核心原理在于：不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象中，2個(gè)理想內(nèi)對(duì)照表達(dá)水平的比值在所有樣本中應(yīng)一致，表達(dá)水平比值變異度的增加意味著待測(cè)單一或2個(gè)內(nèi)對(duì)照表達(dá)穩(wěn)定性的下降。該程序?qū)⒛骋粌?nèi)對(duì)照與其他內(nèi)對(duì)照表達(dá)水平的兩兩比值經(jīng)對(duì)數(shù)變換后，計(jì)算其平均標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定性的平均值M，并對(duì)所有候選內(nèi)對(duì)照的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序[16]。本研究選用β-actin、GAPDH、B2M、U6、18S rRNA和HSA-miR-1 6個(gè)不同功能的常用內(nèi)對(duì)照作為早期死亡時(shí)間研究的候選內(nèi)對(duì)照。GAPDH、B2M是常用的作為內(nèi)對(duì)照的管家基因[17]，而18S rRNA和U6常被用作miRNA研究的內(nèi)對(duì)照[18]。目前的研究還發(fā)現(xiàn)HSA-miR-1與心臟的發(fā)育分化及功能相關(guān)[19]。經(jīng)genormPLUS統(tǒng)計(jì)處理后可知，U6表達(dá)最穩(wěn)定，可以作為利用實(shí)時(shí)RT-PCR方法研究早期死亡時(shí)間推斷的內(nèi)對(duì)照。本研究結(jié)果與理論期望也是相符的，U6作為核內(nèi)小RNA更不容易受外界環(huán)境的影響，在死亡早期相對(duì)表達(dá)更穩(wěn)定。

為了排除性別、年齡及死因等對(duì)候選內(nèi)對(duì)照表達(dá)量的影響，本實(shí)驗(yàn)還做了進(jìn)一步的研究，以確定U6可以作為一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)對(duì)照應(yīng)用于死亡時(shí)間推斷研究。結(jié)果表明，U6的表達(dá)與性別、年齡及常見的死因（失血性休克、心源性猝死、顱腦損傷、機(jī)械性窒息）無明顯的相關(guān)性（P＞0.05）。

綜合分析，筆者認(rèn)為利用心肌組織中的U6作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行早期死亡時(shí)間推斷的研究，可以使實(shí)時(shí)RT-PCR的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。穩(wěn)定的內(nèi)對(duì)照選取，可以排除個(gè)體差異帶來的誤差，使統(tǒng)計(jì)結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確，從而發(fā)現(xiàn)具有實(shí)際意義的現(xiàn)象及規(guī)律，以便對(duì)利用實(shí)時(shí)RT-PCR這一方法研究核酸時(shí)間依賴性降解規(guī)律提供更可靠的依據(jù)。進(jìn)一步的工作將在其他常用檢材組織，比如皮膚、骨骼肌、腦、脾等進(jìn)行研究，尋找每個(gè)器官、組織最適合的內(nèi)對(duì)照，以期運(yùn)用其建立多指標(biāo)降解規(guī)律與死亡時(shí)間之間的數(shù)學(xué)模型。

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2011-11-03）

（本文編輯：劉寧國(guó)）

Evaluation on Stability of Internal Controls in Human Cardiac Muscle by Real-Time RT-PCR during Early Postmortem Interval

ZHANG Ping1,MA Kai-jun2,ZHANG Heng1,WANG Hui-jun3,SHEN Yi-wen1,CHEN Long1
（1.Department of Forensic Medicine,Shanghai Medical College,Fudan University,Shanghai 200032,China;2.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence,Institute of Forensic Medicine,Shanghai Public Security Bureau,Shanghai 200043,China;3.Research Center for Children Development and Translational Medicine,Children’s Hospital,Fudan University,Shanghai 201102,China）

Objective To explore the stability of internal controls in human cardiac muscle by real-time RT-PCR during early postmortem interval（PMI）in order to find the most stable marker.Methods Ten individuals with similar environmental conditions（the average store temperature：25℃）and different PMI ranging from 4.3 to 22.3 h were selected.Total RNA was extracted from each sample and six commonly internal controls were used including β-actin,GAPDH,B2M,U6,18S rRNA and HSA-miR-1,and the expression was detected in cardiac muscle by real-time RT-PCR.The expression stability of internal controls was evaluated using genormPLUSsoftware during early PMI.The internal control with the most stability was selected.The relationship between the most stable marker and its expression level affected by some other parameters such as age,gender and cause of death was also analyzed.Results The U6 showed the most stable expression during early PMI in cardiac muscle,and its expression level was not affected by those parameters including age,gender and cause of death（P＞0.05）.Conclusion U6 may be a valuable internal control for the study of relationship between PMI determination and degradation of nucleic acid in human cardiac muscle by real-time RT-PCR.

forensic pathology;reverse transcriptase polymerase chain reaction;myocardium;internal control;postmortem interval

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.001

1004-5619（2012）02-0081-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172896）

張萍（1985—），女，山東德州人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)學(xué)研究；E-mail：09211010058@fudan.edu.cn

陳龍，男，副教授，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)及法醫(yī)臨床學(xué)研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cn