郝 博，高 迪，湯大為，王小廣，劉水平，孔小平，劉 超，黃京璐，畢啟明，權(quán) 力，羅 斌

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510080；2.廣州市公安局番禺區(qū)分局，廣東 廣州 511400；3.廣州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州 510030）

腸道病毒71型在腦干腦炎嬰幼兒腦干中的分布及感染機(jī)制

郝 博1，高 迪1，湯大為1，王小廣1，劉水平1，孔小平2，劉 超3，黃京璐1，畢啟明1，權(quán) 力1，羅 斌1

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510080；2.廣州市公安局番禺區(qū)分局，廣東 廣州 511400；3.廣州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州 510030）

目的 觀察人腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）以及細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecules-1，ICAM-1）在腦干腦炎死亡的嬰幼兒腦干中的表達(dá)及分布特點(diǎn)，探討EV71進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制以及ICAM-1的參與作用。 方法 收集22例尸檢確認(rèn)為腦干腦炎嬰幼兒的腦干組織為實(shí)驗(yàn)組，并以10例先天性心臟病死亡嬰幼兒的腦干組織作為對(duì)照組。選擇實(shí)驗(yàn)組中鏡下小血管呈典型的“袖套樣”改變的切片進(jìn)行EV71-VP1免疫組織化學(xué)染色，然后對(duì)EV71-VP1陽性的切片進(jìn)行ICAM-1免疫組織化學(xué)染色。染色結(jié)果經(jīng)圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的染色結(jié)果。 結(jié)果 （1）實(shí)驗(yàn)組EV71-VP1免疫組織化學(xué)陽性染色呈深棕黃色，主要位于腦干星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，對(duì)照組染色呈陰性。（2）ICAM-1陽性呈深棕黃色，在腦干血管周圍炎癥細(xì)胞、膠質(zhì)小結(jié)內(nèi)的炎癥細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)升高，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。 結(jié)論 EV71可作為腦干腦炎致死嬰幼兒法醫(yī)病理診斷的篩選依據(jù)。EV71可能通過血源性侵染腦干，ICAM-1可能在腦干炎癥改變過程中起重要作用。

法醫(yī)病理學(xué)；手足口病；腸道病毒屬；細(xì)胞間黏附分子1

腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是引起嬰幼兒手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）主要病原體之一。5歲以下兒童易感HFMD，多數(shù)病例預(yù)后較好，少部分病例后果嚴(yán)重，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎、腦脊髓炎、心肌炎、急性遲緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫等，可在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致死亡。本研究以疑似EV71致死的嬰幼兒腦干組織為研究對(duì)象，通過EV71-VP1多克隆抗體特異性結(jié)合EV71衣殼蛋白VP1區(qū)檢測EV71在腦干中的分布，并通過細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecules-1，ICAM-1）多克隆抗體檢測ICAM-1在腦干中的表達(dá)，旨在探討EV71侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制以及ICAM-1在此機(jī)制中的作用，以期為此類案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

收集2006—2010年中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心診斷為腦干腦炎死亡的嬰幼兒腦干組織蠟塊22例為實(shí)驗(yàn)組，其中臨床EV71病毒檢測確診為HFMD 4例；以10例先天性心臟病死亡嬰幼兒的腦干組織蠟塊作為對(duì)照組。所有嬰幼兒尸體均為低溫保存1～3d后進(jìn)行的解剖檢驗(yàn)，提取的腦干（包括中腦、腦橋、延髓）組織經(jīng)置10%甲醛溶液中固定72h后，制成蠟塊保存。取組織蠟塊重新制作常規(guī)切片后進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色。

1.2 病例資料

實(shí)驗(yàn)組均有完整的病歷資料，多以發(fā)熱，胃腸道不適，體表、口腔及咽峽部炎性皰疹為主要首發(fā)癥狀（1例在治療過程中四肢出現(xiàn)皰疹），發(fā)病季節(jié)以春、夏季為主，發(fā)熱呈不規(guī)則熱，36.4～40℃，病程1～6 d。除發(fā)熱外，部分病例伴有咳嗽、氣促、抽搐、嘔吐、腹瀉等癥狀，部分病例無特殊臨床癥狀。大部分嬰幼兒被診斷為“上感”、“嬰幼兒肺炎”、“嬰幼兒腹瀉”，經(jīng)“抗感染、對(duì)癥治療”病情仍惡化，短時(shí)間內(nèi)死亡；小部分嬰幼兒診斷為“手足口病”，且采用規(guī)范抗病毒治療，仍短時(shí)間死亡。

尸體解剖見雙手指甲床發(fā)紺，體表皮膚可見皰疹，腦組織輕度水腫。鏡下除3例外病理改變基本一致，腦膜、腦內(nèi)血管擴(kuò)張充血，腦組織疏松，神經(jīng)細(xì)胞及血管周隙增寬，腦實(shí)質(zhì)未見出血、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，腦神經(jīng)元無明顯壞死表現(xiàn)。部分腦實(shí)質(zhì)內(nèi)見膠質(zhì)細(xì)胞增生，形成膠質(zhì)小結(jié)，腦干大部分小血管周圍見較多炎癥細(xì)胞呈“袖套樣”浸潤。19例于尸體解剖時(shí)曾抽右心室血送中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行IgE濃度檢測（ELISA法），其中8例IgE檢測結(jié)果升高，為127.00～932.00IU/mL（正常參考值0～120IU/mL）。

1.3 試劑

兔抗人EV71-VP1多克隆抗體（0.2 mL）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔ICAM-1多克隆抗體（0.2mL）、生物素化的羊抗兔IgG抗體、即用型SABC免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 HE染色

取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組切片經(jīng)HE染色后顯微鏡下觀察，選出實(shí)驗(yàn)組中鏡下小血管呈典型“袖套樣”改變的腦干組織（中腦、腦橋、延髓）切片，供免疫組織化學(xué)染色。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

將對(duì)照組切片和經(jīng)HE染色后選出的實(shí)驗(yàn)組切片經(jīng)3%甲醇-過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫靜置10min；PBS溶液洗片3次，每次5min；參照SABC使用說明，以EDTA溶液（pH=6.0）行高壓熱修復(fù)法修復(fù)抗原10 min；PBS溶液洗片3次，每次5min，滴加正常山羊血清，室溫保濕孵育20min；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別滴加1∶50稀釋的EV71-VP1抗體。隨機(jī)另取實(shí)驗(yàn)組中4個(gè)案例的切片以PBS溶液代替一抗作為空白對(duì)照組，4℃保濕孵育過夜；37℃復(fù)溫45 min，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫保濕孵育20 min；PBS溶液洗片3次，每次5 min，滴加DAB顯色溶液，顯微鏡下觀察顯色結(jié)果（約2min）；終止反應(yīng)后以蘇木素復(fù)染1min，1%鹽酸-乙醇分化，自來水中返藍(lán)30min；烤箱中56℃烘干10min，二甲苯透明，中性樹膠封片。

EV71-VP1免疫組織化學(xué)陽性者按照上述步驟進(jìn)行ICAM-1（CD54）多克隆抗體免疫組織化學(xué)染色、觀察、統(tǒng)計(jì)。

1.6 結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

EV71-VP1抗體及ICAM-1抗體免疫組織化學(xué)染色陽性均呈深棕黃色顆粒狀。隨機(jī)選取每張切片中5個(gè)呈“袖套樣”改變的小血管視野（×100），使用Image-Pro Plus 6.0軟件測定小血管周圍EV71-VP1抗體陽性細(xì)胞數(shù)及“袖套樣”分布炎癥細(xì)胞陽性反應(yīng)物的平均光密度值，數(shù)據(jù)均用±s表示。采用SPSS 16.0軟件，以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

實(shí)驗(yàn)組小血管周圍炎癥細(xì)胞呈典型的“袖套樣”分布，對(duì)照組未見該形態(tài)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 EV71-VP1免疫組織化學(xué)染色

對(duì)照組未見EV71-VP1抗體陽性反應(yīng)細(xì)胞（圖1A）。

實(shí)驗(yàn)組中有19例EV71-VP1抗體免疫組織化學(xué)染色陽性，判斷為EV71感染陽性；另外3例未見陽性染色，判斷為其他病毒感染的腦干腦炎。EV71-VP1陽性者陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組及EV71-VP1陰性者（表1）。其中EV71-VP1抗體陽性反應(yīng)表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿、胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，“袖套樣”改變小血管周圍膠質(zhì)細(xì)胞胞漿、胞核內(nèi)有少量表達(dá)，而神經(jīng)元中EV71-VP1陽性表達(dá)較星形膠質(zhì)細(xì)胞弱（圖1B）；膠質(zhì)小結(jié)中部分細(xì)胞呈陽性染色（圖1C），數(shù)量相對(duì)于血管周圍腦實(shí)質(zhì)無明顯增多。

圖1 EV71-VP1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表1 各組EV71-VP1免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.2.2 ICAM-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

對(duì)照組未見典型ICAM-1陽性反應(yīng)細(xì)胞（圖2A）。

實(shí)驗(yàn)組19例EV71-VP1抗體免疫組織化學(xué)染色陽性者，小血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿、小血管周圍炎癥細(xì)胞胞漿、血管周圍腦組織膠質(zhì)細(xì)胞胞漿可見ICAM-1陽性表達(dá)（圖2B～D）。對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組所測得的平均光密度，經(jīng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖2 ICAM-1免疫組織化學(xué)結(jié)果

表2 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（EV71-VP1抗體陽性者）ICAM-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

3 討 論

EV71屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬中人類A型腸道病毒的一種，基因組為單股正鏈RNA，長度約為7 400個(gè)核苷酸，僅含有一個(gè)開放讀碼框，編碼的多聚蛋白約含2190個(gè)氨基酸。該多聚蛋白可進(jìn)一步水解成P1、P2和P3前體蛋白，P1前體蛋白編碼VP1、VP2、VP3和VP4結(jié)構(gòu)蛋白，P2和P3編碼7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（2A～2C和3A～3D）。4種結(jié)構(gòu)蛋白中除VP4包埋在病毒衣殼的內(nèi)側(cè)與核心緊密連接外，其他3種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面，因而抗原決定簇基本上位于VP1～VP3上。EV71最早在加利福尼亞州有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的嬰兒糞便中分離出，為HFMD最常見病原體之一，感染性強(qiáng)，致病率高，目前尚無針對(duì)性的治療方法[1]。HFMD案例1980年在中國首次報(bào)道，此后每年都有一定數(shù)量案例報(bào)道[2]。2008年中國HFMD爆發(fā)，發(fā)病人數(shù)超過176000，至少40人死亡[3]。據(jù)廣東省疾病控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2009年僅廣東省發(fā)病人數(shù)就有92749[2]。2008—2009年國家傳染病信息管理系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示HFMD輕度癥狀者EV71實(shí)驗(yàn)室檢查陽性率為52.6%，重度癥狀者為83.5%，致死者為96.1%[4]。對(duì)于EV71致HFMD的發(fā)病及死亡機(jī)制，通過尸體解剖、動(dòng)物模型研究，學(xué)者們推測EV71可能通過血源性、神經(jīng)源性或其他途徑感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5-6]。

致死案例病理學(xué)觀察見中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)以炎性改變?yōu)橹鞯膿p害[6-8]。EV71所致腦炎為典型的病毒性腦炎病理改變，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害形式固定，表現(xiàn)為腦組織小血管周圍炎癥細(xì)胞“袖套樣”聚集、腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞間隙增寬、噬神經(jīng)現(xiàn)象，部分腦實(shí)質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)小結(jié)形成，腦干部位較多受累[3，5，7]。Hsueh等[9]研究表明EV71單克隆抗體免疫熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，但對(duì)于EV71主要侵襲的部位、侵襲的細(xì)胞類型未作說明。其他動(dòng)物模型雖然可以模擬出EV71所致的臨床、病理學(xué)表現(xiàn)，但對(duì)于病毒分布也未作明確說明[5-6]。Wong等[5]采用免疫組織化學(xué)、原位雜交技術(shù)研究7例EV71致死案例，發(fā)現(xiàn)EV71主要位于腦干、脊髓前角炎癥明顯區(qū)域的神經(jīng)元及周圍的炎癥細(xì)胞，而非神經(jīng)元細(xì)胞未見明顯表達(dá)，從而推測EV71致病機(jī)制可能是通過外周神經(jīng)逆向感染中樞神經(jīng)途徑。本研究中EV71-VP1多克隆抗體免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示EV71主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿、胞核，“袖套樣”改變小血管周圍膠質(zhì)細(xì)胞胞漿、胞核內(nèi)有少量分布；血管內(nèi)皮細(xì)胞及周圍炎癥細(xì)胞胞漿、細(xì)胞核也有少量表達(dá)；神經(jīng)元中有少量表達(dá)。這提示EV71并非親神經(jīng)元性的，而主要是親膠質(zhì)細(xì)胞性的。其原因可能是：星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起伸展充填在神經(jīng)元胞體及其突起之間，在調(diào)節(jié)突觸傳遞及神經(jīng)元耦合方面起著重要作用，有些突起末端形成腳板，附在毛細(xì)血管壁上組成血腦屏障，或附著在腦和脊髓表面形成膠質(zhì)界膜[10]。本研究免疫組織化學(xué)顯示EV71親星形膠質(zhì)細(xì)胞性，說明其更傾向于通過與星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的腳板結(jié)合，進(jìn)而透過血腦屏障到達(dá)神經(jīng)中樞。

研究表明ICAM-1在顱內(nèi)病毒感染炎癥細(xì)胞聚集過程中發(fā)揮重要作用，提示ICAM-1與炎癥細(xì)胞“袖套樣”浸潤密切相關(guān)[11-12]。ICAM-1屬于黏附蛋白中的免疫球蛋白超家族成員之一，是與細(xì)胞膜結(jié)合的1型糖蛋白，在誘導(dǎo)白細(xì)胞移動(dòng)、淋巴細(xì)胞的激活、其他免疫反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)以及炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，在多種細(xì)胞中都有表達(dá)，如大部分白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞等[13-14]。免疫組織化學(xué)染色顯示，EV71陽性樣本中的ICAM-1主要表達(dá)于“袖套樣”聚集的炎癥細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)小結(jié)膠質(zhì)細(xì)胞。EV71主要侵染的星形膠質(zhì)細(xì)胞是血腦屏障的重要組成部分，激活狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞ICAM-1表達(dá)增多，進(jìn)一步促進(jìn)了腦血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附分子及炎癥介質(zhì)，破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)，使血腦屏障通透性增加，使白細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)聚集，并透過血腦屏障向腦實(shí)質(zhì)的移動(dòng)，聚集的炎癥細(xì)胞可進(jìn)一步表達(dá)ICAM-1[15]。實(shí)驗(yàn)組血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周圍的炎癥細(xì)胞ICAM-1表達(dá)較對(duì)照組顯著增多，因此，ICAM-1可能在EV71侵染引起炎癥細(xì)胞聚集過程中起著重要的作用。

[1] Wu PC，Huang LM，Kao CL，et al.An outbreak of coxsackievirus A16 infection：comparison with other enteroviruses in a preschool in Taipei[J].J Microbiol Immunol Infect，2010，43（4）：271-277.

[2] De W，Changwen K，Wei L，et al.A large outbreak of hand，foot，and mouth disease caused by EV71 and CAV16 in Guangdong，China，2009[J].Arch Virol，2011，156（6）：945-953.

[3] Yang Y，Wang H，Gong E，et al.Neuropathology in 2 cases of fatal enterovirus type 71 infection from a recent epidemic in the People’s Republic of China：a histopathologic， immunohistochemical， and reverse transcription polymerase chain reaction study[J].Hum Pathol，2009，40（9）：1288-1295.

[4] Zhang J，Sun J，Chang Z，et al.Characterization of hand， foot， and mouth disease in China between 2008 and 2009[J].Biomed Environ Sci，2011，24（3）：214-221.

[5] Wong KT，Munisamy B，Ong KC，et al.The distribution of inflammation and virus in human enterovirus 71 encephalomyelitis suggests possible viral spread by neural pathways[J].J Neuropathol Exp Neurol，2008，67（2）：162-169.

[6] Zhang Y，Cui W，Liu L，et al.Pathogenesis study of enterovirus 71 infection in rhesus monkeys[J].Lab Invest，2011，91（9）：1337-1350.

[7] Ooi MH，Wong SC，Lewthwaite P，et al.Clinical features，diagnosis，and management of enterovirus 71[J]. Lancet Neurol，2010，9（11）：1097-1105.

[8] Xu J，Qian Y，Wang S，et al.EV71：an emerging infectious disease vaccine target in the Far East?[J]. Vaccine，2010，28（20）：3516-3521.

[9] Hsueh C，Jung SM，Shih SR，et al.Acute encephalomyelitis during an outbreak of enterovirus type 71 infection in Taiwan：report of an autopsy case with pathologic，immunofluorescence，and molecular studies[J].Mod Pathol，2000，13（11）：1200-1205.

[10]Haydon PG，Carmignoto G.Astrocyte control of synaptic transmission and neurovascular coupling[J].Physiol Rev，2006，86（3）：1009-1031.

[11]Dietrich JB.The adhesion molecule ICAM-1 and its regulation in relation with the blood-brain barrier[J].J Neuroimmunol，2002，128（1-2）：58-68.

[12]Sharma A，Bhomia M，Honnold SP，et al.Role of adhesion molecules and inflammation in Venezuelan equine encephalitis virus infected mouse brain[J].Virol J，2011，8：197.

[13]Hu X，Barnum SR，Wohler JE，et al.Differential ICAM-1 isoform expression regulates the development and progression of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Mol Immunol，2010，47（9）：1692-1700.

[14]Miklossy J，Doudet DD，Schwab C，et al.Role of ICAM-1 in persisting inflammation in Parkinson disease and MPTP monkeys[J].Exp Neurol，2006，197（2）：275-283.

[15]Constantin G.Chemokine signaling and integrin activation in lymphocyte migration into the inflamed brain[J]. J Neuroimmunol，2008，198（1-2）：20-26.

2011-10-12）

（本文編輯：劉寧國）

Distribution of Human Enterovirus 71 in Brainstem of Infants with Brain Stem Encephalitis and Infection Mechanism

HAO Bo1,GAO Di1,TANG Da-wei1,WANG Xiao-guang1,LIU Shui-ping1,Kong Xiao-ping2,LIU Chao3, HUANG Jing-lu1,BI Qi-ming1,QUAN Li1,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080, China;2.Panyu Branch of Guangzhou Public Security Bureau,Guangzhou 511400,China;3.Institute of Criminal Science and Technology,Guangzhou Public Security Bureau,Guangzhou 510030,China）

Objective To explore the mechanism that how human enterovirus 71（EV71）invades the brainstem and how intercellular adhesion molecules-1（ICAM-1）participates by analyzing the expression and distribution of human EV71,and ICAM-1 in brainstem of infants with brain stem encephalitis.Methods Twenty-two brainstem of infants with brain stem encephalitis were collected as the experimental group and 10 brainstems of fatal congenital heart disease were selected as the control group.The sections with perivascular cuffings were selected to observe EV71-VP1 expression by immunohistochemistry method and ICAM-1 expression was detected for the sections with EV71-VP1 positive expression.The staining image analysis and statistics analysis were performed.The experiment and control groups were compared.Results（1）EV71-VP1 positive cells in the experimental group were mainly astrocytes in brainstem with niggerbrown particles,and the control group was negative.（2）ICAM-1 positive cells showed nigger-brown.The expression in inflammatory cells （around blood vessels of brain stem and in glial nodules）and gliocytes increased.The results showed statistical difference comparing with control group（P＜0.05）.Conclusion The brainstem encephalitis can be used to diagnose fatal EV71 infection in infants.EV71 can invade the brainstem via hematogenous route.ICAM-1 may play an important role in the pathogenic process.

forensic pathology;hand,foot and mouth disease;enterovirus;intercellular adhesion molecules-1

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.02.002

1004-5619（2012）02-0085-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39700167）

郝博（1984—），男，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：15820224411@163.com

羅斌，男，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：luobin@mail.sysu.edu.cn