朱長太，鄭瑞娟，王 潔，胡忠義

(同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院，上海200433)

近年來隨著，耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)的出現(xiàn)和蔓延，使得結(jié)核防控更加困難[1,2]。建立可靠的結(jié)核耐藥檢測方法對于結(jié)核病的治療及防控無疑具有重要意義。由此，本文旨在建立一種結(jié)核分枝桿菌菌株耐多藥快速檢測方法，并評價其在臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 202株被BACTEC 960藥敏證實為MDR-TB臨床分離株為上海市肺科醫(yī)院2010年至2011年臨床確診的肺結(jié)核患者的痰標本培養(yǎng)陽性菌株。

1.1.2 主要儀器 PSQ96全自動焦磷酸測序儀 (瑞典Biotage公司)、基因擴增儀 (德國Eppendorf公司)、BACTEC MGIT 960檢測儀 (美國 Dickinson公司)、Gene Genius全自動凝膠成像分析系統(tǒng) (英國Syngene 公司)。

1.1.3 主要試劑 焦磷酸測序試劑盒、鏈親和素包被的磁珠均為瑞典PYROSEQUENCING AB公司產(chǎn)品，Bactec 960試劑購自美國Dickinson公司，Taq酶等PCR擴增體系試劑均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取保存于改良羅氏培養(yǎng)基的結(jié)核分枝桿菌，接種于Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～3周后取1.0 ml液體培養(yǎng)物，80℃水浴保溫30 min滅活菌株，10 000 r/min，離心10 min棄上清，雙蒸水洗滌沉淀后將菌體沉淀重懸于 50μl裂解液中，50℃水浴 1 h，沸水浴 10 min，離心去上清。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 使用PSQ96MA系統(tǒng)自帶軟件Pyrosequencing TM Assay Design軟件，設計rpoB、katG基因PCR擴增引物和焦磷酸測序引物，設計的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。各耐藥基因PCR反應體系為50μl：基因組模板2.0μl，4種脫氧核苷三磷酸的終濃度各為0.2 mmol/L，上、下游引物的終濃度各為0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U。PCR反應循環(huán)參數(shù)除退火溫度為：95℃預變性5 min；94℃30 s，72℃ 30 s，共 50個循環(huán)，72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物固定后，純化單鏈模板，進行焦磷酸測序。運用Identifire分析軟件，將測序所得序列與MTB標準菌株耐藥基因序列進行比對，確定結(jié)核桿菌臨床分離株各基因的突變類型和突變位置。

1.2.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算焦磷酸測序技術(shù)檢測MDR-TB的靈敏度及特異度。

1.2.4 質(zhì)量控制 MTB標準菌株(H37Rv,ATCC27294)為本研究的質(zhì)控株。

2 結(jié)果

本研究中，我們確定表1中DNA序列作為rpoB、katG基因PCR擴增引物和焦磷酸測序引物來檢測結(jié)核菌利福平及異煙肼耐藥性。我們以焦磷酸測序同時檢測到rpoB基因及katG基因突變判讀為MDR-TB，結(jié)果顯示：202株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，焦磷酸測序檢測到MDR-TB共計154株；以BACTEC MGIT 960檢測結(jié)果為判讀標準，則焦磷酸測序法檢測MDR靈敏度為72.8%[95%可信區(qū)間 (confidence interval:CI):66.3%～78.4%]，特異度為 90.0%(95%CI:80.1～95.1%)。 耐多藥結(jié)核分枝桿菌焦磷酸測序檢測結(jié)果表2。

表1 rpoB、katG基因PCR擴增引物和焦磷酸測序引物

表2 耐多藥結(jié)核分枝桿菌焦磷酸測序檢測結(jié)果

3 討論

結(jié)核病耐藥是目前全球關(guān)注的一個公共衛(wèi)生問題，已嚴重威脅到人類的健康。目前結(jié)核耐藥檢測常規(guī)方法多采用細菌學藥敏方法，該方法所需時間長，不能及時為臨床提供用藥指導。焦磷酸測序技術(shù)是一種新近發(fā)明的以檢測DNA合成過程中所產(chǎn)生的焦磷酸為基礎(chǔ)的實時DNA測序技術(shù)[3,4]。焦磷酸測序技術(shù)實際上依靠四種酶(DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、螢光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)及兩種底物(APS和熒光素)完成。與Sanger法不同，焦磷酸測序技術(shù)依賴于核苷酸摻入中焦磷酸鹽的釋放，而非雙脫氧核苷三磷酸參與的鏈終止反應[5]。目前，焦磷酸測序技術(shù)已被廣泛應用于病原微生物快速鑒定、病毒與細菌分型、突變檢測及藥物基因組學等各個方面[6-9]。

本研究我們建立焦磷酸測序檢測異煙肼、利福平藥物耐藥性方法，BACTEC 960法以利福平及異煙肼同時耐藥判讀為MDR，而焦磷酸測序法以同時檢測到rpoB基因及katG基因突變判讀為MDR。在202株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，焦磷酸測序檢測到MDR-TB共計154株。以BACTEC960檢測結(jié)果為判讀標準，焦磷酸測序法檢測MDR靈敏度為72.8%(95%CI:66.3%～78.4%)， 特異度為 90.0%(95%CI:80.1%～95.1%)。從研究結(jié)果來看，新確立的焦磷酸測序技術(shù)可檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼的耐藥性，具有較高的特異性與靈敏度。與Sanger法相比，焦磷酸測序技術(shù)具有高通量、低成本、檢測報告時間更短等優(yōu)勢[9]，由此我們認為新建立的焦磷酸測序技術(shù)可作為耐多藥結(jié)核分枝桿菌藥敏實用的檢測工具，值得臨床推廣應用。

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