付冬蓮，袁國輝，賴玉珍，周 麗

(南昌市青云譜區(qū)疾病預(yù)防控制中心,江西 南昌330006)

近期,江西省技術(shù)質(zhì)量監(jiān)督局受理了我疾控中心提出的實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定和食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定二合一的申請，并向我疾控中心檢驗(yàn)科發(fā)放了微生物考核盲樣,以此來綜合檢測實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備的性能、實(shí)驗(yàn)試劑的質(zhì)量及技術(shù)人員操作能力,此次考核有益于提高檢驗(yàn)人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)和實(shí)驗(yàn)室的檢測能力[1]?，F(xiàn)將我中心檢驗(yàn)科的盲樣考核結(jié)果及檢驗(yàn)過程報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 由江西省疾病預(yù)防控制中心發(fā)放的混合菌盲樣(編號(hào)為03號(hào),螺旋小試管內(nèi)裝腦心浸液肉湯,要求5個(gè)工作日內(nèi)報(bào)告盲樣中的病原菌)。

1.2 培養(yǎng)基 、試劑 培養(yǎng)基及生化反應(yīng)管均由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供;API20E、API Listeria均購自法國梅里埃(上海)生物有限公司，均在有效期內(nèi),培養(yǎng)基均經(jīng)過質(zhì)量控制，符合質(zhì)量要求才使用。

1.3 診斷血清 沙門菌診斷血清和志賀菌診斷血清:寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn);均在有效期內(nèi)。

1.4 檢驗(yàn)方法 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB4789-2010、GB4789-2012

2 檢驗(yàn)方法與步驟

2.1 直接分離培養(yǎng) (以下實(shí)驗(yàn)中所采用的培養(yǎng)溫度均為 36℃，20h，但MYP為30℃48 h)拿到混合菌盲樣時(shí)，觀察菌種管有無破損 ，及時(shí)進(jìn)行菌種的分離與鑒定，無菌操作，打開菌種管，首先進(jìn)行涂片做革蘭染色鏡檢，革蘭染色鏡檢結(jié)果是革蘭無芽胞陽性短桿菌和革蘭陰性無芽胞桿菌 ；根據(jù)革蘭染色鏡檢的結(jié)果，選用相應(yīng)的培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、SS、XLD、4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂、BPK、MYP、沙門菌顯色培養(yǎng)基、志賀菌顯色培養(yǎng)基、O157顯色培養(yǎng)基、李斯特菌顯色培養(yǎng)基、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基，經(jīng)過16h、36℃培養(yǎng)后觀察結(jié)果(其中BPK瓊脂、李斯特菌顯色培養(yǎng)基需48h才能觀察結(jié)果)。

2.2 純培養(yǎng) (1)觀察經(jīng)選擇性瓊脂平板直接分離培養(yǎng)的菌落特征，SS瓊脂平板上有兩種菌落 ：一種無色半透明，圓形，菌落中心帶黑色，另一種為無色半透明菌落；XLD瓊脂平板上有兩種菌落：一種為粉紅色，菌落中心呈現(xiàn)大的黑色中心，另一種為粉紅色菌落；沙門菌顯色培養(yǎng)基平板：一種紫色圓形中等大小菌落，一種白色小菌落；志賀菌顯色培養(yǎng)基：一種為黑色幾乎占滿整個(gè)菌落，邊緣為無色的菌落；一種為中心為淡藍(lán)色，邊緣為無色的菌落；營養(yǎng)瓊脂：一種為無色中等大小的菌落，一種為稍大些，呈梨型無色菌落；一種為無色稍小的帶黏性，接種環(huán)不易挑取的菌落；血瓊脂平板上有三種菌落：一種為灰白色，中等大小，不透明；一種為灰白色，稍大些，不透明，表面光滑；另一種灰白色，中等大小，不透明,有狹窄溶血環(huán)；挑取營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、SS、XLD、沙門菌顯色培養(yǎng)基、志賀菌顯色培養(yǎng)基上的生長的可疑菌落分別接種于三糖鐵斜面及賴氨酸脫羧酶生化管；其余4號(hào)瓊脂、TCBS瓊脂、BPK、MYP、O157顯色培養(yǎng)基、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基均未生長出與選擇培養(yǎng)基對應(yīng)的可疑菌落。(2)挑取在單核細(xì)胞增生李斯特菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)48h的淺藍(lán)色的帶暈輪樣落菌落接種于木糖、鼠李糖生化管，同時(shí)于TSA-YE平板純化。

2.3 進(jìn)一步生化反應(yīng) (1)三糖鐵斜面36℃、20h觀察形成兩種結(jié)果:①革蘭陰性直桿菌，無芽胞，無莢膜:K/AG,底部為黑色；賴氨酸脫羧酶陽性;②革蘭陰性短桿菌，無芽胞，無莢膜：K/A，底部為黃色；賴氨酸脫羧酶陰性；挑?、俚募兣囵B(yǎng)物做靛基質(zhì)、pH7.2尿素、氰化鉀三項(xiàng)生化；同時(shí)挑?、偌阿诩兣囵B(yǎng)物分別接種API20E生化試劑盒。(2)選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、動(dòng)力、溶血試驗(yàn)，同時(shí)接種API Listeria生化試劑盒。

2.4 生化反應(yīng)及結(jié)果 (1)上述①經(jīng)API20E生化試驗(yàn)，生化反應(yīng)顯示ONPG-ADH+LDC+ODC+CIT+H2S+URE-TDA-IND-VP-GEI-GLU+MAN-INOSOR+RHA-SAC-MEL+AMY-ARA-OX-,結(jié)果判定為沙門菌屬(79.0%id，用血清學(xué)試驗(yàn)確證)；觀察靛基質(zhì)、pH7.2尿素、氰化鉀三項(xiàng)生化，全部為陰性；上述②經(jīng)API20E生化試驗(yàn)，生化反應(yīng)顯示ONPG+ADH-LDC-ODC+CIT-H2S-URE-TDAIND-VP-GEI-GLU+MAN+INO-SOR-RHA+SACMEL-AMY-ARA+OX-結(jié)果判定為志賀菌屬(89.0%id，用血清學(xué)試驗(yàn)確證)；同時(shí)補(bǔ)做三項(xiàng)生化葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、黏液酸鹽，均為陰性。(2)上述木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物革蘭染色為革蘭陽性短桿菌，用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡下觀察，該菌出現(xiàn)翻滾樣的運(yùn)動(dòng)；在SIM動(dòng)力培養(yǎng)基呈月牙狀生長；在羊血瓊脂平板上刺種周圍產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)；APIListeria生化反應(yīng)結(jié)果具體見表1,查李斯特菌數(shù)碼圖譜(2510)提示為單核細(xì)胞增生李斯特菌。

表1 API Listeria生化反應(yīng)結(jié)果

2.5 血清學(xué)分型 取上 述①的純培養(yǎng)物與沙門菌屬診斷血清中的 A～F多價(jià)O血清及單因子血清做玻片凝集試驗(yàn) ,同時(shí)用生理鹽水做對照,血清學(xué)分型鑒定結(jié)果為腸炎沙門氏菌(1,9,12,g,m);取上 述②的純培養(yǎng)物與志賀菌屬診斷血清中的四種多價(jià)血清及分型血清做玻片凝集試驗(yàn) ，同時(shí)用生理鹽水做對照 ，血清學(xué)分型結(jié)果為宋內(nèi)志賀菌I型 ，同時(shí)用宋內(nèi)志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株做比對,比對結(jié)果一致。

3 鑒定結(jié)果

綜合以上菌落形態(tài)、染色鏡檢、生化試驗(yàn) 、血清學(xué)分型試驗(yàn)結(jié)果,報(bào)告盲樣03號(hào)腦心浸液肉湯混合菌樣品檢出腸炎沙門菌和宋內(nèi)志賀菌I型以及單核細(xì)胞增生李斯特菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與省疾控中心的結(jié)果完全符合。

4 討論

4.1 本次微生物考核盲樣分離培養(yǎng)首先采用海博顯色培養(yǎng)基，在顯色培養(yǎng)基上生長的紫色的沙門菌菌落、白色的志賀菌落、藍(lán)色的單核細(xì)胞增生李斯特菌落特征明顯,顏色分明，易于判讀和挑取，可以防止漏檢，同時(shí)簡化了檢測步驟，針對性更強(qiáng)。

4.2 考核盲樣往往是2～3株菌株接種于同一樣本中,而考核者接種時(shí)又特意加大某種或減少某種菌株的量,制造一定的難度,此次考核樣中沙門菌為優(yōu)勢菌，在SS、XLD、營養(yǎng)瓊脂血瓊脂、沙門菌及志賀菌顯色培養(yǎng)基上的菌落生長遠(yuǎn)遠(yuǎn)覆蓋了整個(gè)平皿，稍不留意，志賀菌落很難被發(fā)現(xiàn)，但因我們平時(shí)工作中多加注意識(shí)別,不同細(xì)菌菌落之間還是有一定區(qū)別的,故被考核者必須嚴(yán)格遵守相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),認(rèn)真操作,不可操之過急,注意把握好增菌,分離,培養(yǎng)的時(shí)間,將考核工作與平時(shí)工作結(jié)合起來,把好各個(gè)環(huán)節(jié),與平時(shí)摸索出的一些微生物生長的特點(diǎn)有機(jī)運(yùn)用起來,使樣品中非優(yōu)勢菌也能被檢出[2]。

4.3 在志賀菌的補(bǔ)充微量生化反應(yīng)中,我們發(fā)現(xiàn),葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽的試驗(yàn)應(yīng)在規(guī)定的48h內(nèi)看結(jié)果，同時(shí)要注意掌握接種生化管的菌量要適量，否則會(huì)出現(xiàn)判斷失誤。

細(xì)菌檢驗(yàn)質(zhì)量控制直接關(guān)系到細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,是衛(wèi)生監(jiān)測不可缺少的部分。參加微生物盲樣考核,有利于督促和提高檢驗(yàn)人員的專業(yè)檢測水平,增加檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性和正確性[3]。

[1]紀(jì) 靜.一次微生物實(shí)驗(yàn)室室間比對的報(bào)告和體會(huì)[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,29(3):275-276.

[2]李蘇英.盲樣菌株微生物室間質(zhì)控考核分析[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,18(1):3.

[3]陳文勝,劉禮怦,羅建波,等.衛(wèi)生微生物實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的探討[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2004,14(5):624-625.