李亮

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物選擇 選用健康4～5周雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量約 (120±20)g。由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑及儀器 主要試劑:豬甲狀腺球蛋白 (Sigma公司，貨號:T1126)100mg;完全弗氏佐劑 (Sigma公司，貨號:F5881)10ml;不完全弗氏佐劑 (Sigma公司，貨號:F5506)40ml，各兩份。FT3試劑盒 (貨號:L2KF32)、FT4試劑盒 (貨號:L2KF42)、促甲狀腺激素 (TSH)試劑盒 (貨號:L2KTS2)、TGAb試劑盒 (貨號:LKTG1)、TPOAb試劑盒 (貨號:L2KTO2)，均由西門子有限公司提供。主要儀器:Vir 723可見光分光光度計 (上海精密儀器有限公司生產(chǎn))、H－600型透射電鏡 (日本日立公司)，LKB－V型超薄切片機(jī)，低溫高速離心機(jī)、低溫冰箱、德普自動生化分析儀?2000(天津德普診斷產(chǎn)品有限公司)、電子秤，精密天平，手術(shù)刀、剪、鑷子、操作臺等。

1.1.3 藥物 散結(jié)消癭方:蜣螂蟲5g，莪術(shù)15g，三棱15g，土貝母15g，瓦楞子15g，郁金10g，貓爪草30g，柴胡10g，濃縮為濃度1g/ml液體藥。雷公藤片 (三九黃石制藥廠生產(chǎn)，批號:070805)制成0.1mg/ml溶液。碘化鈉 (天津恒興化學(xué)制劑有限公司)100g。

1.2 方法

1.2.1 分組 將健康的雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量約(120±20)g，購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組:正常組 (G1)15只;模型組 (G2)15只;雷公藤治療組 (G3)15只;散結(jié)消癭方組 (G4)15只;

1.2.2 造模方法 G1組給予普通飼料飼養(yǎng);G2～G4組造模:將甲狀腺球蛋白100mg完全溶解于雙蒸水50ml中，取10ml與等體積完全弗化劑充分混合成油包水狀，取0.5ml在背、腹腔、腿、頸部等多點皮下注射為初次免疫，2周后取甲狀腺球蛋白10ml與不完全弗化劑10ml充分混合后作加強(qiáng)免疫，每周1次，配合高碘水 (1L水中加入0.64g碘化鈉配制)引水喂養(yǎng)至第5周［1］;第6周開始，G2組給予普通飼料及飲水飼養(yǎng)至10周;G3組給予雷公藤片1.08mg·kg－1·d－1〔給藥方法按照動物每日用量 =成人每日用量 ×0.162×大鼠體質(zhì)量(g)/150［2］〕灌胃至 10 周。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法 實驗第11周處理大鼠，禁食8h后稱重，用10%水合氯醛麻醉 (劑量40mg/kg［3］)，腹腔注射，15min后大鼠已處于麻醉狀態(tài)，分兩部分操作:一部分球后靜脈取血，其中2ml給予肝素抗凝，余離心取血清備用;另一部分取出甲狀腺組織約5mm3，以10%甲醛5ml固定，石蠟包埋切片后HE染色，光鏡下檢測，拍照紀(jì)錄;各組實驗大鼠取出甲狀腺組織，制成HE染色切片，光鏡下觀察病理變化分級指數(shù)，評分標(biāo)準(zhǔn)［4－5］:0分:甲狀腺內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤;1分:甲狀腺間質(zhì)浸潤炎性細(xì)胞分布于2個或多個濾泡;2分:每個甲狀腺濾泡的內(nèi)有1～2個炎性細(xì)胞浸潤;3分:炎性細(xì)胞浸潤了10%～40%的甲狀腺;4分:炎性細(xì)胞浸潤了40%以上的甲狀腺。分級標(biāo)準(zhǔn):1級:0～1分，2級:1～2分，3級:2～3分，4級:3～4分。將取好的血液離心后取血清置于2～8℃保存?zhèn)溆?。FT3、FT4、TSH、TGAb和TPOAb檢測按劑盒說明進(jìn)行操作、讀數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以 (±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清甲狀腺球蛋白抗體及過氧化物酶抗體的變化 模型組TGAb和TPOAb較正常組升高，具有顯著性差異(P＜0.01)。雷公藤治療組TGAb和TPOAb較模型組降低，有顯著性差異 (P＜0.05);散結(jié)消癭方組TGAb和TPOAb較模型組降低，有顯著性差異 (P＜0.01，見表1)。

2.2 各組大鼠甲狀腺功能的變化 TSH含量正常組、模型組、雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組間無顯著性差異 (P＞0.05);FT3、FT4含量正常組、模型組、雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組間無差異 (P＞0.05，見表2)。

2.3 各組大鼠病理指數(shù) 模型組淋巴細(xì)胞浸潤程度較正常組明顯增多，范圍明顯增大，具有顯著性差異 (P＜0.05)。雷公藤治療組淋巴細(xì)胞浸潤程度較模型組顯著降低，范圍明顯縮小，有顯著性差異 (P＜0.05);散結(jié)消癭方組淋巴細(xì)胞浸潤程度較模型組顯著降低，范圍明顯縮小，有顯著性差異 (P＜0.01，見表3)。

表1 各組大鼠血清TGAb和TPOAb比較 (±s，U/mL)Table 1 Comparison of serum TGAb and TPOA in each group

表1 各組大鼠血清TGAb和TPOAb比較 (±s，U/mL)Table 1 Comparison of serum TGAb and TPOA in each group

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05;與雷公藤組比較，#P＞0.05

?

表2 各組大鼠甲狀腺功能比較 (±s)Table 2 Comparison of thyroid function in each group

表2 各組大鼠甲狀腺功能比較 (±s)Table 2 Comparison of thyroid function in each group

注:與模型組比較，*P＜0.05

?

表3 各組大鼠病理指數(shù)分級變化 (±s)Table 3 Comparison of pathology index grade in each group

表3 各組大鼠病理指數(shù)分級變化 (±s)Table 3 Comparison of pathology index grade in each group

注:與正常組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.01

?

3 討論

自身免疫性甲狀腺炎是在遺傳基礎(chǔ)上因性別、精神、感染、免疫等因素共同誘發(fā)的疾病。其外觀上表現(xiàn)為彌漫性甲狀腺腫大，中醫(yī)病機(jī)屬氣、痰、血交阻于頸前下部而成。

3.1 實驗結(jié)果分析 經(jīng)過5周的治療后，在炎性細(xì)胞浸潤程度上，發(fā)現(xiàn)雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組淋巴細(xì)胞浸潤程度較模型組明顯減低，范圍明顯縮小，濾泡上皮細(xì)胞嗜酸性變也明顯變淺，說明雷公藤、散結(jié)消癭方都可以減少淋巴細(xì)胞的炎性浸潤，減低其免疫炎性反應(yīng)。但散節(jié)消癭方組淋巴細(xì)胞浸潤程度較雷公藤治療組明顯減少，范圍縮小，說明散結(jié)消癭方較雷公藤治療組更能有效減少淋巴細(xì)胞的炎性浸潤，更好地控制自身免疫性炎的炎性反應(yīng)。經(jīng)治療后雷公藤治療組、散結(jié)消癭方組大鼠TGAb和TPOAb較模型組有所降低，有顯著性差異，說明雷公藤、散結(jié)消癭方都可以減少自身免疫性甲狀腺炎自身抗體的形成，減低其自身免疫反應(yīng);散結(jié)消癭方組大鼠TGAb和TPOAb較雷公藤治療組無顯著。值得注意的是，TGAb和TPOAb主要對于自身免疫性甲狀腺炎的診斷有重要意義，但并不是判斷疾病好轉(zhuǎn)的惟一指標(biāo)，在臨床上也觀察到部分患者疾病的控制和好轉(zhuǎn)與TGAb和TPOAb的下降并不是呈絕對相關(guān)性，本試驗說明結(jié)果散結(jié)消癭方及雷公藤可以抑制自身免疫性甲狀腺炎的自身抗體形成的體液免疫應(yīng)答。

3.2 TGAb和TPOAb的特征及致病機(jī)制 TGAb和TPOAb是自身免疫性甲狀腺炎的特征性和標(biāo)志性自身抗體［10］，其形成主要與T淋巴細(xì)胞的免疫缺陷有關(guān)。淋巴細(xì)胞分為輔助性T淋巴細(xì)胞 (Th)和抑制性T淋巴細(xì)胞 (Ts)，由于正常Ts活性不足，抗原TG和甲狀腺過氧化物酶 (TPO)刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體 (TGAb和TPOAb)，形成免疫復(fù)合物來對甲狀腺細(xì)胞發(fā)揮損傷作用。甲狀腺球蛋白是一種相對分子質(zhì)量為660kD的球狀同源二聚體糖蛋白，含有兩個主要和一個次要的自身抗體結(jié)合位點，其抗體 TGAb包括 IgG1、IgG2、IgG3、IgG44個亞類，以IgG1和IgG4占優(yōu)勢，以IgG2功能活性最高［11］，但若有高水平的IgG2、IgG4亞型出現(xiàn)則提示有發(fā)展為甲狀腺功能減退的傾向［12］，高滴度的TGAb與甲狀腺有纖維性病變關(guān)系密切。TGAb可加重對非顯性T細(xì)胞抗原決定簇自身免疫反應(yīng)的擴(kuò)大，從而導(dǎo)致自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)生及惡化。TPO是一種分子質(zhì)量為100～105kD的膜結(jié)合蛋白，是參與甲狀腺激素合成的一種主要酶，其抗體甲狀腺過氧化物酶抗體 (TPOAb)以IgG1及IgG4亞類為主。在自身免疫性甲狀腺炎患者中存在既能結(jié)合TG也能結(jié)合TPO的雙特異性自身抗體，它的產(chǎn)生可能是由于TPO與TG有同源性的抗原決定簇。TPOAb的致病作用包括:(1)ADCC。(2)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用 (CDC)。(3)TPO在甲狀腺激素合成中起重要作用，散結(jié)消癭方通過減少TGAb和TPOAb，來抑制自身免疫性甲狀腺炎的免疫應(yīng)答。

本實驗中觀察到，光鏡下正常組大鼠甲狀腺見少量濾泡上皮細(xì)胞，背景膠質(zhì)豐富，呈濃稠片狀分布，未見巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，上皮細(xì)胞未見嗜酸性改變。而模型組間質(zhì)內(nèi)見廣泛淋巴浸潤，濾泡上皮嗜酸性變，并見淋巴組織分布于小葉內(nèi)及小葉周邊，形成具有生發(fā)中心的淋巴小結(jié)。甲狀腺濾泡明顯減少，呈散在分布，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞變性、破壞，類膠質(zhì)減少。而雷公藤組、散節(jié)消癭方組間質(zhì)內(nèi)淋巴浸潤較模型組顯著減少，小葉內(nèi)及小葉周邊形成具有生發(fā)中心的淋巴濾泡較模型組也減少。濾泡上皮嗜酸性變較模型組顏色淺，而散結(jié)消癭方組淋巴細(xì)胞浸潤較雷公藤組明顯減少，說明散結(jié)消癭方能減少自身免疫性甲狀腺炎的炎性細(xì)胞浸潤，從病理上有效抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生。

散結(jié)消癭方對減少自身免疫性甲狀腺炎的炎性反應(yīng)、自身抗體的形成以及減小腫大的甲狀腺療效均優(yōu)于雷公藤，推測散結(jié)消癭方通過活血通絡(luò)、消癭化結(jié)可以軟化腫大的甲狀腺，減輕氣、痰、瘀在頸下的交阻，通過大量破血、活血藥的相互搭配可以有效控制自身免疫反應(yīng)對甲狀腺組織的損害。從組方上看，散結(jié)消癭方由蜣螂蟲、莪術(shù)、三棱、土貝母、瓦楞子、郁金、貓爪草、柴胡組成;方中蜣螂蟲破瘀、攻毒、消癥，為方中君藥，莪術(shù)、三棱共同配伍破血化瘀、專治頑癖癥瘕結(jié)塊，苦能泄而辛能散，甘能和而入脾，血屬陰而有形，所以相互配伍能治一切凝結(jié)停滯有形之堅積，對于自身免疫性甲狀腺炎患者的頸下結(jié)節(jié)、腫塊，或伴局部疼痛等癥起到活血化瘀、縮小癭結(jié)的作用，土貝母清熱化痰，散結(jié)解毒，主治痰核、瘰疬等因痰所致諸疾。貓爪草具有清熱解毒、軟堅化痰、散結(jié)消腫功效，善治頸上瘰疬結(jié)核。土貝母、貓爪草起祛痰散結(jié)的作用。瓦楞子軟堅散瘀，消積除痰，治療痰積、癭瘤、瘰疬、痰核，用于頑痰、癥瘕等證。郁金善治肝郁氣滯血瘀所致的胸脅脹痛等證，善于疏肝理氣，郁金、土貝母、瓦楞子、貓爪草配伍，共化癭病之痰血瘀阻，為方中佐藥。柴胡苦平而微寒，能除熱散結(jié)而解表，故能愈以上諸病，為方中使藥，是少陽、厥陰的引經(jīng)之藥。現(xiàn)代藥理表明，柴胡有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用，其成分柴胡多糖有提高細(xì)胞和體液免疫功能，抑制T淋巴細(xì)胞受體的生成，有免疫抑制的作用，配伍郁金能疏解肝郁，理氣散結(jié)。全方藥物配伍共奏理氣、活血、散結(jié)之效。溫腎健脾方有溫補(bǔ)脾腎功能，腎乃先天之本，脾乃后天氣血化生之源，脾腎和免疫功能息息相關(guān)，脾腎功能調(diào)和，則全身氣血生化有源，免疫力強(qiáng)，本實驗證實了散結(jié)消癭方可以抑制節(jié)自身免疫性甲狀腺炎大鼠體液免疫應(yīng)答，減輕自身抗體的ADCC及炎癥反應(yīng)。

散結(jié)消癭方能活血通絡(luò)，消癭化結(jié)，主治痰血互結(jié)甲狀腺腫大，能減少甲狀腺自身抗體 (TGAb、TPOAb)的形成，減少淋巴細(xì)胞的浸潤，減輕自身免疫性甲狀腺炎的自身免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，且能縮小彌漫性腫大的甲狀腺組織。

1 劉建文.藥理實驗方法學(xué) ［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007，2:175.

2 呂延杰.藥理學(xué)實驗指導(dǎo) ［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008，4:17－19.

3 秦川.醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué) ［M］.北京:人民衛(wèi)生出版，2008:415－416.

4 王堅，王揚(yáng)天.自身免疫性甲狀腺疾病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展 ［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2001，14(5):441－443.

5 Ajjan RA，Weetman AP.Pathogenesis of autoimmune thyroid disease.//Paul S.Contemporary immunology:auto－ immune reactions［M］.Humana Press Inc，Totowa，NJ，1999:31－59.

6 Xie LD，Gao Y.Distribution of immunoglobulin G subclasses of antithyroid peroxidase antibody in sera from patients with Hashimoto's thyroiditis with different thyroid functional status ［J］.Clin Exp Immunol，2008，154(2):172－176.