劉 巖， 李 泱， 林 琨， 田 苗， 王玉堂， 單兆亮△

(解放軍總醫(yī)院 1心內(nèi)科， 2老年心血管病研究所，北京 100853)

1000-4718(2012)05-0839-07

2011-11-24

2012-03-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30772886)

△通訊作者 Tel: 010-55499312; E-mail：shanzl301@sina.com

胡椒堿減輕H2O2引起的兔心房肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流及超速激活延遲整流鉀電流的異常改變*

劉 巖1， 李 泱2， 林 琨1， 田 苗1， 王玉堂1， 單兆亮1△

(解放軍總醫(yī)院1心內(nèi)科，2老年心血管病研究所，北京 100853)

目的研究胡椒堿對(duì)H2O2引起的兔單個(gè)心房肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流(IK1)及超速激活的延遲整流鉀電流(IKUr)異常的影響。方法采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分析50 μmol/L H2O2對(duì)兔單個(gè)心房肌細(xì)胞IK1和IKUr的影響，并研究預(yù)先應(yīng)用7 μmol/L胡椒堿對(duì)其的保護(hù)作用。結(jié)果7 μmol/L胡椒堿對(duì)正常兔心房肌細(xì)胞IK1和IKUr及其通道動(dòng)力學(xué)無(wú)顯著影響。在50 μmol/L H2O2作用下,兔心房肌細(xì)胞IK1峰值由(-148.2±16.7)pA/pF降低至(-64.2±9.8)pA/pF (P<0.05)，電流-電壓曲線上移；而IKUr峰值由(16.0±2.1)pA/pF降低至(6.1±1.4)pA/pF (P<0.05)，電流-電壓曲線下移，通道穩(wěn)態(tài)激活曲線右移，通道穩(wěn)態(tài)失活曲線左移及恢復(fù)時(shí)間減慢，而且存在頻率依賴性特征。預(yù)先給予7 μmol/L胡椒堿，明顯減輕H2O2對(duì)IK1和IKUr的抑制作用(P<0.01)，并可減少H2O2對(duì)超速激活延遲整流鉀通道動(dòng)力學(xué)的異常影響。結(jié)論胡椒堿可減輕氧化應(yīng)激對(duì)心房肌細(xì)胞IK1和IKUr的影響。

胡椒堿； 過(guò)氧化氫； 心房肌細(xì)胞； 內(nèi)向整流鉀電流； 超速激活延遲整流鉀電流

胡椒堿(piperine, PIP)在胡椒科植物中廣泛存在，屬中、蒙、藏醫(yī)常用藥物。胡椒堿通過(guò)抑制自由基和活性氧簇的產(chǎn)生，能夠降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的巰基、抗氧化分子及抗氧化酶類有顯著保護(hù)作用[1]。研究顯示，胡椒堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心房肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用[2]，而H2O2對(duì)心房肌細(xì)胞電生理的影響，胡椒堿是否有保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文擬用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流(inward rectifier potassium current,IK1)及超速激活延遲整流鉀電流(ultra rapid delayed rectifier potassium current,IKUr)的影響，以及胡椒堿的保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1溶液與試劑

膠原酶II 、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天冬氨酸鉀、丙酮酸鈉、Mg-ATP、HEPES、CaCl2、CdCl2、BaCl2和4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)均購(gòu)自Sigma；EGTA購(gòu)自Fluka Biochemika；其它試劑均為分析純。

1.1Tyrode液的組成成份(mmol/L) NaCl 135，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，glucose 10，用NaOH 調(diào)pH值至7.3；無(wú)鈣Tyrode液和0.2 mmol/L Ca2+Tyrode液，分別為Tyrode 液中不加CaCl2和加0.2 mmol/L CaCl2。

1.2記錄鉀電流的細(xì)胞外液(mmol/L)N-methyl-D-glucamine(NMG) 149，MgCl25，CaCl20.65，HEPES 5，用HCl調(diào)pH值至7.4。

1.3細(xì)胞內(nèi)液(mmol/L) KCl 45，天冬氨酸鉀 85，丙酮酸鈉 5，Mg-ATP 5.0，EGTA 10，HEPES 10，glucose 11，用KOH調(diào)pH值至7.4。

1.4細(xì)胞保護(hù)液(KB液，mmol/L) KOH 110，taurine 10，oxalic acid 10，glutamic acid 70，KCl 25，KH3PO410，EGTA 5，HEPES 5，glucose 10，用KOH調(diào) pH至7.4。

2兔單個(gè)心房肌細(xì)胞分離

成年新西蘭大耳白兔(約1.0～1.5 kg) 購(gòu)自中國(guó)人民解放軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。按文獻(xiàn)[3-5]采用酶解法制備心房肌單細(xì)胞并進(jìn)行了改進(jìn)。取新西蘭白兔(約1.0～1.5 kg) 經(jīng)腹腔20%水合氯醛(2 mL/kg)麻醉，迅速取心臟，在37 ℃和通氧條件下行Langendorff 灌流。用無(wú)Ca2+Tyrode液灌流3～5 min，用含II型膠原酶70 mg、胰蛋白酶12 mg無(wú)Ca2+Tyrode液灌流(50 mL) 25～30 min以消化心房肌。沿房室間溝取心房肌，剪碎入KB液中并吹打使細(xì)胞脫落，-4 ℃保存，1 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取保存液加于1 mL灌流槽中，待細(xì)胞貼壁后，于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無(wú)顆粒、橫紋清晰、無(wú)收縮的細(xì)胞，在37 ℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3細(xì)胞的處理及藥物的應(yīng)用

細(xì)胞共分4組：(1)不經(jīng)任何處理，為對(duì)照組，直接進(jìn)行鉗制并記錄電流；(2) 經(jīng)50 μmol/L H2O2培養(yǎng)0.5 h后鉗制并記錄電流；(3)預(yù)先經(jīng)7 μmol/L胡椒堿培養(yǎng)1 h后再加入50 μmol/L的H2O2培養(yǎng)0.5 h鉗制并記錄電流；(4) 經(jīng)7 μmol/L胡椒堿培養(yǎng)1.5 h后鉗制并記錄電流。

4干擾電流的排除

4.1記錄IK1于細(xì)胞外液加入多非利特(dofetilide,Dof) 5 nmol/L阻斷IKr，CdCl2100 μmol/L阻斷ICa,L，河豚毒素(tetrodotoxin,TTX) 100 μmol/L阻斷INa。

4.2記錄IKUr于細(xì)胞外液加入BaCl2200 μmol/L阻斷IK1，加入Dof 5 nmol/L阻斷IKr，CdCl2100 μmol/L阻斷ICa,L，TTX 100 μmol/L阻斷INa。

5膜片鉗全細(xì)胞記錄

采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電流鉗模式下記錄動(dòng)作電位；在電壓鉗制下記錄電流。膜片鉗放大器(AXON-700B，USA)同計(jì)算機(jī)連接。刺激信號(hào)及電壓輸入信號(hào)的采集均由pCLAMP軟件控制。玻璃毛坯(GG-17) 經(jīng)微電極拉制儀(Narishige, pp-83) 拉制成電阻為2.0 ～ 4.5 MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維操縱器進(jìn)行封接， 使封接電阻達(dá)1 GΩ 以上， 吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。測(cè)定電容時(shí)，施以0.4 V/s 的斜坡刺激，測(cè)電流并按方程Cm=I/ (dV/dt) 計(jì)算，其中Cm為膜電容，I為電流值，dV/dt即電壓斜率。為消除細(xì)胞間誤差， 電流值以電流密度(pA/pF) 表示。信號(hào)經(jīng)截止頻率為1 kHz 的四階貝塞爾低通濾波器濾波， 采樣率為5 kHz。

6誘發(fā)電流參數(shù)的設(shè)定

6.1IK1的峰值電流測(cè)定 保持電位-80 mV，給予-190 mV～+10 mV、300 ms脈沖，記錄IK1。

6.2IK1電流-電壓曲線測(cè)定 保持電位-80 mV，給予-190 mV～+10 mV、300 ms的脈沖，記錄IK1。以電流密度與測(cè)試電壓作圖，得IK1的電流-電壓曲線。

6.3IKUr的峰值電流測(cè)定 保持電位-80 mV，施予-40 mV、20 ms預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予-50～ +50 mV、2 000 ms的脈沖，記錄IKUr。

6.4IKUr電流-電壓曲線測(cè)定 保持電位-80 mV，施予-40 mV、20 ms預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予-50～+50 mV、2 000 ms的脈沖，記錄IKUr。以電流密度與測(cè)試電壓作圖，得IKUr的電流-電壓曲線。

6.5IKUr穩(wěn)態(tài)激活曲線測(cè)定 保持電位-80 mV，施予-40 mV、20 ms預(yù)刺激失活鈉通道，隨即給予-60～+70 mV、2 000 ms脈沖，記錄IKUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對(duì)電流對(duì)各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)激活曲線，并用Boltzmann 方程I/Imax={1+exp[-(V1/2-Vm)/k]}-1進(jìn)行曲線擬合，其中V1/2為半激活電壓，k為激活曲線斜率。

6.6IKUr穩(wěn)態(tài)失活曲線測(cè)定 采用典型的雙刺激模式，保持電位-80 mV，施予-40 mV、20 ms的預(yù)刺激失活鈉通道，緊接著給予+60 mV、5 000 ms的條件刺激，緊接著給予-50 ～+45 mV、 階躍5 mV的系列測(cè)試刺激，記錄IKUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對(duì)電流對(duì)各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)失活曲線。用Boltzmann方程I/Imax={1+exp[-(V1/2-Vm)/k]}-1進(jìn)行曲線擬合求出半失活電壓 (V1/2) 和曲線斜率(k)。

6.7IKUr失活后恢復(fù)曲線測(cè)定 采用典型的雙刺激模式，保持電位-80 mV，施予-40 mV、20 ms的預(yù)刺激失活鈉通道，緊接著給予+60 mV、2 000 ms刺激，間隔1.5、3.0、6.0、12.5、25、50、100、200、400、800 ms 不同時(shí)間，給予+60 mV、2 000 ms測(cè)試刺激，記錄IKUr。標(biāo)準(zhǔn)化各電流幅值，以相對(duì)電流對(duì)間隔時(shí)間作圖，得失活后恢復(fù)曲線。

6.8IKUr作用頻率依賴性測(cè)定 保持電位-80 mV，給予+60 mV、200 ms重復(fù)刺激，每個(gè)刺激串為20個(gè)刺激脈沖，刺激頻率分別為1 Hz和3 Hz。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌IK1峰值電流密度的影響

當(dāng)細(xì)胞暴露于50 μmol/L H2O2時(shí)，IK1電流密度明顯降低，從對(duì)照組的(-148.2±16.7) pA/pF 降低至(-64.2±9.8)pA/pF，而事先用7 μmol/L 胡椒堿處理細(xì)胞，其電流密度恢復(fù)到(-113.8±15.4)pA/pF，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，而與H2O2組比差異極其顯著(P<0.01,n=16)，而單用胡椒堿組IK1為(-135.5±16.1)pA/pF，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖1。

圖1胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞IK1峰值電流密度的影響

2胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌IK1電流-電壓曲線的影響

從圖2可見(jiàn)，該電流在超極化時(shí)被激活，隨著超極化電壓的增加，電流幅值顯著增大，該電流呈現(xiàn)出明顯的內(nèi)向整流特征，即隨著刺激脈沖向正方向移動(dòng)，電流幅值由于內(nèi)向整流而降低。當(dāng)細(xì)胞暴露于50 μmol/L H2O2時(shí)，IK1在個(gè)電壓下電流密度明顯降低，隨著電壓向著更負(fù)的方向移動(dòng)，這種效應(yīng)更加明顯，在超極化時(shí)尤甚。應(yīng)用7 μmol/L胡椒堿后，電流密度的改變得到緩解，隨著電壓向超極化方向移動(dòng)，藥物效應(yīng)增大，見(jiàn)圖2。

3胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌IKUr峰值電流密度的影響

當(dāng)細(xì)胞暴露于50 μmol/L H2O2時(shí)，IKUr電流密度明顯降低，從對(duì)照組的(16.0±2.1 )pA/pF 降低至(6.1±1.4)pA/pF(P<0.01,n= 18)，而事先用7 μmol/L 胡椒堿處理細(xì)胞，其電流密度恢復(fù)到(11.3±1.8)pA/pF，與H2O2組比差異極其顯著(P<0.01,n=18)。雖然電流密度有所恢復(fù)，但與對(duì)照組相比，仍有明顯差異(P<0.05,n= 18)，見(jiàn)圖3。

圖2胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞IK1電流-電壓曲線的影響

4胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌IKUr電流-電壓曲線的影響

由圖4所示，該電流隨著電壓向去極化方向增加，電流密度增大，且呈一定的外向整流特征。當(dāng)細(xì)胞暴露于50 μmol/L H2O2時(shí)，IKUr在各電壓下電流密度明顯降低，隨著電壓向著去極化的方向移動(dòng)，這種效應(yīng)更加明顯，在-30 mV時(shí)，作用基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)，之后隨著電壓正移，電流密度不再增加，電流-電壓曲線近乎直線。應(yīng)用7 μmol/L胡椒堿后，電流密度的改變得到緩解，尤其是在-50 mV～0 mV的范圍內(nèi)，電流-電壓曲線恢復(fù)尤其明顯，之后隨著電壓向去極化方向移動(dòng)，電流密度雖然有所恢復(fù)，但仍呈一定的穩(wěn)態(tài)特征。這提示胡椒堿在電壓正移至0 mV后作用的電壓依賴性不明顯，見(jiàn)圖4。

圖3胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr峰值電流密度的影響

5胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr激活曲線的影響

細(xì)胞暴露于50 μmol/L H2O2時(shí)，激活曲線右移，即向去極化方向移動(dòng)(圖5A)，V1/2從對(duì)照的(-11.55±0.78)mV移到(-1.07±0.08)mV(n=18,P<0.01)，提示H2O2使通道的激活閾值和通道的充分開(kāi)放電壓右移。應(yīng)用胡椒堿后得以部分恢復(fù)，V1/2變?yōu)?-3.67±0.26)mV(圖5B)。但無(wú)論是應(yīng)用H2O2或加用胡椒堿，k變化不大，4組的k分別為：control:(11.27±1.03)mV；H2O2：(12.71±1.05)mV；H2O2+ PIP：(11.96±0.97)mV，PIP：(11.57±1.13)mV(圖5C)。

6胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr失活曲線的影響

應(yīng)用50 μmol/L H2O2后，失活曲線左移，即向超極化方向移動(dòng)(圖6A)，V1/2從對(duì)照的(-6.76±0.94)mV移到(-15.87±0.62)mV(n= 18,P< 0.01)，同時(shí)應(yīng)用胡椒堿后，此移動(dòng)效應(yīng)得到緩解半失活電壓為(-11.23±1.17)mV(圖6B)。同樣僅用H2O2時(shí)，穩(wěn)態(tài)失活曲線斜率增加，從對(duì)照組的(9.83±0.57)mV升高到(12.46±0.42)mV(n=18,P< 0.05)，應(yīng)用胡椒堿后則升高至(11.27±0.57)mV，提示H2O2可通過(guò)使通過(guò)失活負(fù)移以及升高失活曲線斜率而加速其失活過(guò)程，從而降低電流密度(圖6C)。

圖4胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr電流-電壓曲線的影響

7H2O2對(duì)兔心房肌IKUr失活恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的影響及胡椒堿的作用

從圖7可見(jiàn)，50 μmol/L H2O2可使恢復(fù)曲線明顯減慢，即在同一時(shí)間間隔下，通道恢復(fù)降低，電流幅值減少，此現(xiàn)象在鉗夾100 ms時(shí)表現(xiàn)尤甚，加用胡椒堿后此現(xiàn)象得到緩解。

8H2O2對(duì)兔心房肌IKUr作用頻率依賴性的影響及胡椒堿的作用

對(duì)照組的電流在1 Hz和3 Hz不同頻率刺激下變化不大。而應(yīng)用50 μmol/L H2O2后，無(wú)論是1 Hz還是3 Hz頻率的刺激，均使電流明顯降低，且在3 Hz頻率的刺激時(shí)，電流降低更顯著。同時(shí)灌流H2O2和胡椒堿后，也發(fā)生類似于H2O2的作用結(jié)果，只是電流改變的幅度相對(duì)較小而已，同時(shí)H2O2對(duì)IKUr的抑制作用存在著頻率依賴性或使用依賴性特征，見(jiàn)圖8。

圖5胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr激活曲線的影響

圖6胡椒堿和(或)H2O2對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr失活曲線的影響

圖7H2O2和(或)胡椒堿對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr失活恢復(fù)動(dòng)力學(xué)的影響

圖8H2O2和(或)胡椒堿對(duì)兔心房肌細(xì)胞IKUr作用頻率依賴性的影響

討 論

胡椒堿可以對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，而且3種濃度(7 μmol/L、0.7 μmol/L和0.07 μmol/L) 均有保護(hù)作用，但7 μmol/L效果較好，且對(duì)心肌細(xì)胞無(wú)損傷作用[6]，故本文采用7 μmol/L這一濃度。

本研究結(jié)果表明，在H2O2的作用下，兔心房肌細(xì)胞IK1電流密度明顯降低，使I-V曲線上移；而使IKUr電流密度明顯降低，電流-電壓曲線下移，通道穩(wěn)態(tài)激活曲線右移，通道穩(wěn)態(tài)失活曲線左移及恢復(fù)時(shí)間減慢，而且存在頻率依賴性特征。預(yù)先給予7 μmol/L胡椒堿，明顯減輕H2O2對(duì)IK1和IKUr的抑制作用，并可減輕H2O2對(duì)超速激活的延遲整流鉀通道動(dòng)力學(xué)的異常影響。

IK1主要參與維持心肌細(xì)胞的靜息電位(RP)和動(dòng)作電位(AP)3期快速?gòu)?fù)極化過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)在H2O2的作用下，其抑制兔心房肌細(xì)胞的IK1，H2O2對(duì)IK1的影響國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，徐長(zhǎng)慶等[7]研究顯示H2O2明顯抑制IK1，而Ward等[8]報(bào)道H2O2對(duì)IK1無(wú)明顯影響，但他們的研究均是在心室肌水平。在心房肌水平，本文第一次揭示了H2O2對(duì)心房肌細(xì)胞IK1的抑制作用。這種抑制作用必然導(dǎo)致其RP降低，使閾刺激變小，可導(dǎo)致心房肌細(xì)胞興奮性增強(qiáng)；另外IK1是背景鉀電流，其抑制也會(huì)造成心房肌細(xì)胞自律性增強(qiáng)，上述兩種作用必然導(dǎo)致在H2O2抑制IK1的情況下，心房肌細(xì)胞的興奮性、自律性增強(qiáng)，從而更容易引起心律失常特別是心房顫動(dòng)(房顫)的發(fā)生。大量研究顯示，氧化應(yīng)激與房顫關(guān)系密切[9-11]。而H2O2對(duì)IK1的這種抑制作用，可能就是氧化應(yīng)激與房顫相關(guān)的一部分機(jī)制。

IKUr是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種僅在心房肌細(xì)胞特異表達(dá)的離子通道電流[12]，主要是心房肌細(xì)胞復(fù)極Ⅱ期的外向離子流，能促進(jìn)動(dòng)作電位3期復(fù)極，是有效不應(yīng)期和動(dòng)作電位時(shí)限的決定因素之一[13]，同時(shí)IKUr對(duì)信號(hào)傳遞、心肌細(xì)胞興奮性、不應(yīng)性、傳導(dǎo)性穩(wěn)態(tài)的維持有重要作用[9]。本實(shí)驗(yàn)在H2O2的作用下，兔心房肌細(xì)胞IKUr電流密度明顯降低，電流-電壓曲線下移。H2O2對(duì)心房肌細(xì)胞IKUr的影響國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，僅張光偉等[14]報(bào)道H2O2對(duì)IKUr的影響存在濃度依賴性，H2O2在0.1～0.75 μmol/L，表現(xiàn)為促進(jìn)作用，而在0.75～10 μmol/L，表現(xiàn)為抑制作用，本文濃度為50 μmol/L，與其一致。H2O2對(duì)心房肌細(xì)胞IKUr的抑制，其機(jī)制可能為：通道穩(wěn)態(tài)激活曲線右移，使得在相同電壓條件下，通道激活的數(shù)量減少，電流減??；通道穩(wěn)態(tài)失活曲線左移，使得在相同電壓條件下，通道失活的數(shù)量增多，電流減小；恢復(fù)時(shí)間減慢，使得通道的恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，電流減小，以上3種IKUr通道動(dòng)力學(xué)的變化最終導(dǎo)致在H2O2的作用下，IKUr減小。大量研究顯示：氧化應(yīng)激與心房顫動(dòng)關(guān)系密切[9-11]。所以，H2O2對(duì)IKUr的這種抑制作用可能就是氧化應(yīng)激導(dǎo)致心房肌細(xì)胞發(fā)生電重構(gòu)的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)顯示胡椒堿可以部分對(duì)抗H2O2對(duì)IK1和IKUr的抑制作用，使得IK1和IKUr部分恢復(fù)，其機(jī)制可能為：胡椒堿可以增加內(nèi)源性抗氧化劑的含量，并且可以減輕氧自由基對(duì)多不飽和脂肪酸的攻擊，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而達(dá)到減少氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成傷害的目的[2,15]。另外，胡椒堿還可以直接清除氧自由基，具有直接對(duì)抗H2O2的作用[16]。我們前期研究顯示[2]，在低濃度H2O2的作用下兔左心房肌細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)的活力和谷胱甘肽(GSH)的含量降低，丙二醛(MDA)生成增加；而加入胡椒堿組的上述指標(biāo)顯著改善，SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，是一種重要的抗氧化酶；GSH是大多數(shù)活細(xì)胞中巰基的主要來(lái)源，對(duì)于維護(hù)蛋白巰基適當(dāng)?shù)难趸€原狀態(tài)具有重要作用；MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，可以通過(guò)多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化反應(yīng)引起細(xì)胞損傷。胡椒堿能夠在細(xì)胞受到氧化損傷過(guò)程中增強(qiáng)抗氧化酶的活性，減輕氧自由基對(duì)多不飽和脂肪酸的攻擊，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。從而達(dá)到減少氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成傷害的目的。另外，線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是氧自由基產(chǎn)生的重要部位，有自身的DNA和遺傳體系。mtDNA為閉合環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，在高活性氧自由基的環(huán)境中，極易受到氧化損傷并進(jìn)一步導(dǎo)致突變[17]。當(dāng)損傷到線粒體調(diào)控基因及mtDNA間的協(xié)調(diào)機(jī)制時(shí)，細(xì)胞氧化磷酸化能力受損，線粒體合成ATP的能力下降。由于機(jī)體的需要，mtDNA代償性上調(diào)，從而導(dǎo)致線粒體mRNA表達(dá)增加[18]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)[2]：和對(duì)照組比較，H2O2組線粒體mRNA的表達(dá)明顯增高，而胡椒堿組則無(wú)顯著變化。這提示在細(xì)胞受到H2O2的損傷時(shí)由于功能代償?shù)男枰?mtDNA的拷貝數(shù)增加，而胡椒堿能夠增強(qiáng)抗氧化酶的活性，減少氧自由基的產(chǎn)生，減弱脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)線粒體膜損傷，使得氧化損傷時(shí)線粒體氧化磷酸化的功能得到一定程度的保護(hù)。

所以，本研究從另一個(gè)側(cè)面提示：胡椒堿可以通過(guò)對(duì)抗過(guò)氧化氫來(lái)減輕氧化應(yīng)激對(duì)心房肌的損傷，進(jìn)而阻斷或延緩心房肌細(xì)胞電流的重構(gòu)，進(jìn)而防止或延緩房顫的發(fā)生及維持。

[1] Srinivasan K. Black pepper and its pungent principle-piperine: a review of diverse physiological effects[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2007, 47(8):735-748.

[2] 田 苗, 劉 屏, 王自玲, 等. 胡椒堿減輕兔原代左心房肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用[J]. 心臟雜志, 2011, 23(4):426-428.

[3] 張 然, 余志斌, 王云英. 成年小鼠心肌細(xì)胞分離技術(shù)[J]. 生理學(xué)報(bào), 2004, 56(5):656-660.

[4] 劉忠保, 楊曉麗, 張?zhí)K麗, 等. 抗心臟AT1受體抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞離子電流的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26(11):2118-2123.

[5] 巫少榮, 李自成, 余 健, 等. 大蒜素對(duì)心室肌細(xì)胞膜鈉通道電流的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(4):658-661.

[6] 王 波, 孫 艷, 劉 屏,等. 回心草單體成分對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 22(3):164-167.

[7] 徐長(zhǎng)慶, 李玉榮, 楊寶峰. 氧自由基致豚鼠心室肌細(xì)胞跨膜電位變化的離子電流基礎(chǔ)[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2000, 16(2):121-123.

[8] Ward CA, Giles WR. Ionic mechanism of the effects of hydrogen peroxide in rat ventricular myocytes[J]. J Physiol, 1997, 500(Pt 3):631-642.

[9] Nattel S, Burstein B, Dobrev D. Atrial remodeling and atrial fibrillation: mechanisms and implications[J]. Circ Arrhythmia Electrophysiol, 2008, 1(1):62-73.

[10]Lin YK, Lin FZ, Chen YC, et al. Oxidative stress on pulmonary vein and left atrium arrhythmogenesis[J]. Circ J, 2010, 74(8):1547-1556.

[11]Huang CX, Liu Y, Xia WF, et al. Oxidative stress: A possible pathogenesis of atrial fibrillation[J]. Med Hypothese, 2009, 72 (4):466-467.

[12]Wang Z, Fermini B, Nattel S. Sustained depolarization-induced outward current in human atrial myocytess. Evidence of a novel delayed rectifier K+current similar to Kv 1.5 cloned channel currents[J]. Circ Res, 1993, 73(6):1061-1076.

[13]Van Wagoner DR. Pharmacologic relevance of K+channel remodeling in atrial fibrillation[J]. Mol Cell Cardiol, 2000, 32(10):1763-1766.

[14]張光偉, 谷天祥, 王 春, 等. H2O2對(duì)人心房肌細(xì)胞IKUr和ICa,L的濃度依賴性雙向影響[J]. 生理學(xué)報(bào), 2008, 60(6):695-703.

[15]Hu Y, Guo DH, Liu P, et al. Antioxidant effects of a Rhodobryum roseum extract and its active components in isoproterenol-induced myocardial injury in rats and cardiac myocytess against oxidative stress-triggered damage[J]. Pharmazie, 2009, 64(1):53-57.

[16]Mittal R, Gupta RL.Invitroantioxidant activity of piperine[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2000, 22(5):271-274.

[17]Wallace KB. Doxorubicin induced cardiac mitochondrionopathy[J]. Pharmacol Toxicol, 2003,93(3):105-115.

[18]Chang JC, Kou SJ, Lin WT, et al. Regulatory role of mitochondria in oxidative stress and atherosclerosis[J]. World J Cardiol, 2010, 2(6):150-159.

Effectsofpiperineonabnormalitiesofinwardrectifierpotassiumcurrentandultrarapiddelayedrectifierpotassiumcurrentinducedbyhydrogenperoxideinrabbitatrialmyocytes

LIU Yan1, LI Yang2, LIN Kun1, TIAN Miao1, WANG Yu-tang1, SHAN Zhao-liang1

(1DepartmentofCardiology,2InstituteofGeriatricCardiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China.E-mail:shanzl301@sina.com)

AIM: To study the protective effect of piperine on abnormalityies of inward rectifier potassium current (IK1) and ultra rapid delayed rectifier potassium current (IKUr) induced by hydrogen peroxide (H2O2) in single rabbit atrial myocytes.METHODSThe technique of whole-cell patch-clamp was used to study the effect of H2O2at concentration of 50 μmol/L onIK1andIKUrin single rabbit atrial myocytes. The protective effect of pretreatment with piperine (7 μmol/L) was also observed.RESULTSThe piperine at concentration of 7 μmol/L had no significant effect onIK1andIKUrand their channel dynamics. In the presence of H2O2at concentration of 50 μmol/L, the peak currents ofIK1andIKUrreduced significantly (P<0.05).The steady-state activation curve ofIKUrwas shifted right, the steady-state inactivation curve ofIKUrwas shifted left, and the recovery from inactivation ofIKUrwas shifted downward. TheIKUrshowed frequency-dependent characteristics. Piperine at concentration of 7 μmol/L significantly alleviated the inhibitory effect of H2O2onIK1andIKUr(P<0.01). In addition, piperine protected against the changes ofIKUrdynamics induced by H2O2.CONCLUSIONPiperine alleviates the abnormalities ofIK1andIKUrinduced by oxidative stress in atrial myocytes.

Piperine; Hydrogen peroxide; Atrial myocytes; Inward rectifier potassium current; Ultra rapid delayed rectifier potassium current

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.013