朱洪竹，肖國(guó)強(qiáng)，朱梅菊，陳惠花

毛蕊花苷和馬蒂苷對(duì)遞增大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用

朱洪竹1,2，*肖國(guó)強(qiáng)2，朱梅菊1，陳惠花1

（1. 井岡山大學(xué)體育學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東，廣州 510631）

研究毛蕊花苷和馬蒂苷對(duì)遞增大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體過(guò)氧化損傷的影響。將40只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、單純運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組。觀察毛蕊花苷和馬蒂苷對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠心肌和骨骼肌線粒體SOD酶活性和MDA含量的影響。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組大鼠心肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性明顯高于單純運(yùn)動(dòng)組(< 0.01)；而MDA含量明顯低于單純運(yùn)動(dòng)組(< 0.01)。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組大鼠心肌細(xì)胞線粒體MDA含量低于運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組(< 0.01)；而SOD酶活性與運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組比較，差異無(wú)顯著性(> 0.05)。單純運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性低于運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組(< 0.01)；與運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組比較，差異無(wú)顯著性(> 0.05)；而MDA含量明顯高于運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組(< 0.01)。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性高于運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組(< 0.05)；而MDA含量明顯低于運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組(< 0.01)。毛蕊花苷和馬蒂苷具有提高跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性，促進(jìn)其自由基清除的作用。且毛蕊花苷的作用強(qiáng)于馬蒂苷。

毛蕊花苷；馬蒂苷；線粒體；自由基

馬先蒿屬植物如美觀馬先蒿和蜜穗馬先蒿等，在中醫(yī)藥和民間用于滋陰補(bǔ)腎、補(bǔ)中益氣、健脾和胃，臨床用于治療虛弱、衰老等[1]，效果顯著。有研究發(fā)現(xiàn)，美觀馬先蒿(Franch)的根-太白參，能增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)小鼠身體機(jī)能[2]，其冷提取物能顯著減少氧化損傷和延緩疲勞的發(fā)生[3]。毛蕊花苷和馬蒂苷是馬先蒿屬植物的特征性成分[1]，屬于苯丙素苷類化合物，體外研究顯示具有明顯的抗骨骼肌疲勞作用[4]。我們的前期研究表明，毛蕊花苷和馬蒂苷具有明顯的體內(nèi)抗運(yùn)動(dòng)性疲勞和提高游泳小鼠運(yùn)動(dòng)能力的作用[5]。本研究旨在進(jìn)一步探討其對(duì)遞增大強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體過(guò)氧化損傷的影響，并闡明其抗疲勞的作用機(jī)理，為尋找有效的、無(wú)明顯毒副作用的純天然抗疲勞成分以及馬先蒿屬植物在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性SD大鼠40只，SPF級(jí)，6周齡，體重(277.80 ± 18.29) g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后，按完全隨機(jī)法分為正常對(duì)照組(R)，單純運(yùn)動(dòng)組(E)，運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組(VE)，運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組(ME)。每組10只，分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫(24~25)℃。

1.2 毛蕊花苷和馬蒂苷的分離與提取

毛蕊花苷和馬蒂苷是我們課題組從長(zhǎng)舟馬先蒿中分離得到的[6]，放4 ℃冰箱保存?zhèn)溆??；衔锏慕Y(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

1.3 藥物處理及給藥方法

毛蕊花苷和馬蒂苷分別用生理鹽水溶解，使用灌胃法，每天灌胃1次。藥物劑量換算參照文獻(xiàn)[7]。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組(毛蕊花苷，10 mg/kg)，運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組(馬蒂苷，10 mg/kg)。正常對(duì)照組和單純運(yùn)動(dòng)組以等體積生理鹽水（2 mL/只）灌胃。每次實(shí)驗(yàn)前2 h進(jìn)行灌胃，實(shí)驗(yàn)時(shí)間3周。

1.4 運(yùn)動(dòng)方式

除正常對(duì)照組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練外, 各組動(dòng)物在動(dòng)物跑臺(tái)( 天津運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所研制)上進(jìn)行坡度為0°為期3周（每周7次，1次/天）的跑臺(tái)訓(xùn)練。訓(xùn)練方案參照汶希等[8]建立的大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞模型。具體訓(xùn)練方案見(jiàn)表1。第3周末各組大鼠均進(jìn)行一次跑臺(tái)力竭訓(xùn)練，并記錄力竭時(shí)間。當(dāng)運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)腹部與跑道接觸呈臥位跑，反應(yīng)遲鈍，對(duì)捕捉者“逃避”反應(yīng)差，停止運(yùn)動(dòng)后呈臥位倦怠表現(xiàn)，說(shuō)明大鼠已達(dá)到力竭。

表1 大鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案( m/min×min)

1.5 線粒體的提取與制備

力竭大鼠運(yùn)動(dòng)后即刻, 1%戊巴比妥腹腔麻醉, 迅速取出心臟和左下肢趾長(zhǎng)伸肌肌腹, 分別用冰冷的生理鹽水漂洗, 除去血液, 濾紙拭干, 稱重, 放入小燒杯, 加入勻漿介質(zhì),剪碎, 組織勻漿器勻漿, 在0~4℃條件下用差速離心法分別提取骨骼肌和心肌線粒體[9]。

1.6 SOD活性和MDA含量測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸 (TBA) 縮合法測(cè)定，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，所有操作均嚴(yán)格按照操作書(shū)說(shuō)明進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 毛蕊花苷和馬蒂苷對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠心肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性和MDA含量的影響

研究結(jié)果顯示正常對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷大鼠心肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性，差異無(wú)顯著性（均> 0.05）。單純運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性明顯低于這三組（均< 0.01）。單純運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組大鼠心肌細(xì)胞線粒體MDA含量顯著高于正常對(duì)照組（均< 0.01）；運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組大鼠心肌細(xì)胞線粒體MDA含量明顯低于單純運(yùn)動(dòng)組（均< 0.01）。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組大鼠心肌細(xì)胞線粒體MDA含量低于運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組（< 0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 毛蕊花苷和馬蒂苷對(duì)心肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性(μ/mgprot)和MDA含量(nmol/ml)的影響（n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，1）< 0.01 ；與單純運(yùn)動(dòng)組比較，2）< 0.01 ；與運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組比較，3）< 0.05，4）< 0.01。

2.2 毛蕊花苷和馬蒂苷對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性和MDA含量的影響

研究結(jié)果顯示正常對(duì)照組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性高于單純運(yùn)動(dòng)組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組（均< 0.01）；和運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組比較，差異無(wú)顯著性（> 0.05）。單純運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性低于運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組（< 0.01）；而與運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組比較，差異無(wú)顯著性（> 0.05）。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性高于運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組（< 0.05）。運(yùn)動(dòng)各組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體MDA含量顯著高于正常對(duì)照組（均< 0.01）。單純運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體MDA含量明顯高于運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組（均< 0.01）。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體MDA含量明顯低于運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組（< 0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 毛蕊花苷和馬蒂苷對(duì)骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性(μ/mgprot)和MDA含量(nmol/mL)的影響（n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，1）< 0.01 ；與單純運(yùn)動(dòng)組比較，2）< 0.01 ；與運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組比較，3）< 0.05，4）< 0.01。

3 討論

SOD活性和MDA含量是反映機(jī)體自由基代謝的最敏感指標(biāo)之一。G?khan M.et al研究顯示，長(zhǎng)時(shí)間的遞增負(fù)荷訓(xùn)練會(huì)造成機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物反應(yīng)增強(qiáng)，隨著脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的增加，會(huì)導(dǎo)致膜流動(dòng)性、通透性和興奮性的的降低[10]，導(dǎo)致疲勞的出現(xiàn)。經(jīng)典的抗氧化劑可有效延緩疲勞的發(fā)生[11]。本項(xiàng)研究結(jié)果表明單純運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體MDA含量顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致的自由基產(chǎn)物的大量增加是運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生的主要原因之一。運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組和運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組大鼠心肌和骨骼肌線粒體MDA含量低于單純運(yùn)動(dòng)組，表明這二種苯丙素苷類化合物具有明顯的體內(nèi)清除自由基作用。同時(shí)運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD活性高于單純運(yùn)動(dòng)組，運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組大鼠心肌細(xì)胞線粒體SOD活性高于單純運(yùn)動(dòng)組，提示這二種苯丙素苷類化合物有可能通過(guò)提高運(yùn)動(dòng)大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD酶活性，加速自由基的清除，從而有效地降低了運(yùn)動(dòng)所致大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體氧化損傷。由于線粒體不但是肌肉活動(dòng)所需能量的提供者，而且是細(xì)胞中調(diào)節(jié)Ca2+代謝的重要器官之一，在調(diào)節(jié)胞漿Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，是保證心肌和骨骼肌細(xì)胞正常功能的基礎(chǔ)。因此我們推測(cè)這二種苯丙素苷類化合物對(duì)遞增大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用可能是其產(chǎn)生較強(qiáng)的抗疲勞作用機(jī)理之一[5]。

毛蕊花苷和馬蒂苷屬于苯丙素苷類化合物，抗氧化作用是該類化合物的主要活性之一[12]。且研究亦表明這類苯丙素苷清除氧自由基和抗氧化損傷的能力依賴于分子中羥基的數(shù)目；其抗自由基損傷的能力與羥基的數(shù)目成正比，即羥基越多，抗氧化損傷的能力就越強(qiáng)[13]。毛蕊花苷和馬蒂苷中都有兩個(gè)相同的苯酚環(huán)，其中毛蕊花苷的每個(gè)苯酚環(huán)上均有兩個(gè)鄰位羥基，而馬蒂苷的每個(gè)苯酚環(huán)上相對(duì)應(yīng)的鄰位羥基中有一個(gè)被甲氧基取代。因此，理論上推測(cè)毛蕊花苷清除氧自由基和抗氧化的能力應(yīng)強(qiáng)于馬蒂苷。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)+毛蕊花苷組心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體MDA含量顯著低于運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組，而骨骼肌細(xì)胞線粒體SOD活性高于運(yùn)動(dòng)+馬蒂苷組，也進(jìn)一步證實(shí)了毛蕊花苷清除氧自由基和抗氧化的能力強(qiáng)于馬蒂苷。由于運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的大量增加引起線粒體的損傷密切相關(guān)[14]，因此，這些苯丙素苷清除自由基和抗氧化的能力越高，其保護(hù)心肌和骨骼肌線粒體的能力就越強(qiáng)。故毛蕊花苷抗運(yùn)動(dòng)性疲勞和提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力的作用強(qiáng)于馬蒂苷[5]。

綜上所述，遞增大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致大鼠心肌和骨骼肌細(xì)胞線粒體過(guò)氧化損傷，補(bǔ)充毛蕊花苷和馬蒂苷對(duì)其有良好的保護(hù)作用。其機(jī)制可能是毛蕊花苷和馬蒂苷能提高心肌和骨骼肌細(xì)胞抗氧化能力，減少自由基生成，減輕大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)其造成的過(guò)氧化損傷。且毛蕊花苷的作用強(qiáng)于馬蒂苷。本研究為馬先蒿屬植物在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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EFFECTS OF VERBASCOSIDE AND MARTYNOSIDE ON PROTECTING MYOCARDIUM AND SKELETAL MUSCLE CELL’S MITOCHONDRIA FROM THE DAMAGE MADE BY PEROXIDATION IN INCREASING TRAINED RATS

ZHU Hong-zhu1,2,*XIAO Guo-qiang2, ZHU Mei-ju1, CHEN Hui-hua1

( 1. School of PE & Sports Science, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009,China; 2. School of PE & Sports Science, South China Normal University, Guangzhou, Guangdong 510631, China)

: To study the effects of verbascoside and martynoside on protecting myocardium and skeletal muscle cell’s mitochondria from the damage made by peroxidation in increasing trained rats.: Forty rats were randomly divided into 4 groups as normal group, exercise group, exercise + verbascoside group and exercise + martynoside group with ten mice in each group to study the effects of verbascoside and martynoside on superoxide dismutase (SOD) activity and malonyldialdehyde (MDA) levels of cardiac muscle and skeletal muscle mitochondria in over-trained rats.: The SOD activities of myocardial mitochondria in cardiac muscle in the exercise + verbascoside group and exercise + martynoside group were higher than those of the exercise group (< 0.01), while the levels of MDA were opposite. The levels of MDA of myocardial mitochondria in cardiac muscle in the exercise + verbascoside group were higher than these of the exercise + martynoside group (< 0.01), but there are no significant difference in the SOD activities of myocardial mitochondria in cardiac muscle between these two groups (> 0.05). The SOD activities of myocardial mitochondria in skeletal muscle in the exercise group were lower than these of the exercise + verbascoside group (< 0.01), but there are no significant difference in the SOD activities of myocardial mitochondria in skeletal muscle between the exercise group and exercise + martynoside group (> 0.05). The levels of MDA of myocardial mitochondria in skeletal muscle in the exercise group were significantly higher compared with the exercise + verbascoside group and exercise + martynoside group (< 0.01). The SOD activities of myocardial mitochondria in skeletal muscle in the exercise + verbascoside group were higher than these of the exercise + martynoside group (< 0.01), but the levels of MDA were opposite (> 0.05).: Verbascoside and martynoside were found to have significant effects in increasing SOD activity, facilitating free radicals removal, and thus protecting the myocardial mitochondria in cardiac muscle and skeletal muscle from free radical damage. Verbascoside was more active than martynoside.

verbascoside; martynoside; myocardial mitochondria; free radical

G804.7

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.06.018

1674-8085(2012)06-0081-05

2012-05-12；

2012-09-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160217)

朱洪竹(1976-)，女, 湖南婁底人，講師，博士研究生，主要從事運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究(E-mail: xiaogqde@ 163.com);

*肖國(guó)強(qiáng)(1949-)，男，湖北人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究(E-mail:zhxq197508@163.com);

朱梅菊(1968-)，女，湖南雙峰人，教授，博士，主要從事運(yùn)動(dòng)性疲勞的中醫(yī)藥防治研究(E-mail: zhu_mj@163.com);

陳惠花(1969-)，女，江西吉安縣人，實(shí)驗(yàn)員，主要從事運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究(E-mail: 360225974@qq.com).