李 晨，白承之，李玉英，王轉(zhuǎn)花*

(化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

一種薏苡抗真菌蛋白的制備及抑菌活性研究

李 晨，白承之，李玉英，王轉(zhuǎn)花*

(化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006)

以薏苡(Coix chinensis)種子為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)脫脂、水提、Resource S陽(yáng)離子交換層析和Superdex 75凝膠排阻層析等步驟純化得到一種新的抗真菌蛋白，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行初步鑒定。SDS-PAGE分析顯示該蛋白的分子質(zhì)量約為28kD。抑菌活性鑒定表明，該蛋白對(duì)鏈格孢霉(Alternaria alternate)、綠色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus) 3株絲狀真菌具有顯著的生長(zhǎng)抑制活性，并呈現(xiàn)出劑量依賴的特征。本研究建立分離薏苡28kD抗真菌蛋白的方法，制備方法簡(jiǎn)單易行，所得產(chǎn)品純度達(dá)到95%以上。

薏苡種子；抗真菌蛋白；純化

植物種子中普遍含有一種或幾種抗真菌蛋白(antifungal proteins，AFPs)，這類蛋白賦予植物種子或植株抵抗真菌侵蝕的能力。天然植物AFPs具有來(lái)源廣泛，抗菌譜廣，無(wú)污染等特點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)之一。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)有些AFPs還可以抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶[1-3]。近年來(lái)，陸續(xù)有多種植物來(lái)源的AFPs被純化和鑒定[4]，這些蛋白的分子質(zhì)量大小不同，從幾千到60kD不等。2005年，巴西科學(xué)家在高粱種子中純化并鑒定了一種分子量為30kD的抗真菌蛋白[5]。國(guó)內(nèi)學(xué)者先后從花生[6]、黑豆[7]、紅扁豆[8]中純化得到抗真菌蛋白并對(duì)它們的抑菌活性進(jìn)行了鑒定。

薏苡為禾本科一年生或多年生草本植物，去除外殼和種皮的種仁可入藥，《本草綱目》中提及薏苡種子“健脾益胃、補(bǔ)肺清熱、祛風(fēng)勝溫、強(qiáng)筋骨”。薏苡種子富含脂肪、多種氨基酸、大量的VB1、VB2以及鈣、磷、鎂、鉀等生物活性成分，是非常有價(jià)值的藥食同源食品[9]。薏苡在我國(guó)大部分地區(qū)均有種植，國(guó)家對(duì)薏苡種子的開發(fā)利用也很重視。最近，研究者從薏苡麩皮中提取出幾種可以抑制乳腺癌細(xì)胞的小分子活性物質(zhì)[10]。2008年，劉靜等[11]以薏苡蛋白為實(shí)驗(yàn)材料篩選其中的抗菌成分，獲得一種分子質(zhì)量約38kD的抗真菌蛋白。一種植物中可能含有多種AFPs[12]，有關(guān)薏苡中新的抗菌蛋白及其詳細(xì)的抑菌活性有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)以薏苡種子為材料提取其總蛋白，通過(guò)兩步層析分離，純化得到一種抗真菌蛋白，并對(duì)該蛋白的分子質(zhì)量和抑菌活性進(jìn)行研究，為深入開展制備植物種子來(lái)源的抗真菌蛋白提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與儀器

鏈格孢霉(Alternaria a lternata)、白腐菌(Panus conchatus)、綠色木霉(Trichoderma reesei)由山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

薏苡種子購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

Resource S離子交換層析柱、Superdex 75 10/300 GL層析柱 美國(guó)GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 薏苡種子抗真菌蛋白的純化

薏苡種子經(jīng)過(guò)低溫干燥后粉碎，過(guò)0.2mm孔徑篩網(wǎng)，以3:1(V/m)的比例加入丙酮，4℃攪拌脫脂3h后減壓抽濾，向所得濾餅中加入乙醚，低溫?cái)嚢?h，減壓抽濾，濾餅低溫干燥后即為薏苡種子脫脂粉。取薏苡種子脫脂粉20g，加入200m L浸提緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，4℃攪拌浸提6h，12000×g離心，取上清，加入硫酸銨至80%飽和度，攪拌提取6h，12000×g離心，沉淀用少量浸提緩沖液溶解后透析，所得蛋白溶液為薏苡種子水溶性總蛋白。

將上述水溶性總蛋白用平衡緩沖液充分透析平衡后，上樣于Resource S陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行分離。平衡緩沖液為20mm ol/L NH4OAc，pH 4.5，洗脫緩沖液為20mmol NH4OAc，1mol/L、pH 4.5的NaCl溶液，控制流速為0.5m L/m in，用0.1、0.2、1mol/L的NaC l洗脫緩沖液進(jìn)行不連續(xù)梯度洗脫，收集各洗脫峰，并進(jìn)行抗真菌活性的分析。

將具有抑菌活性的洗脫組分上樣于Superdex 75 10/300 GL凝膠層析柱進(jìn)一步分離，緩沖液為20mmol/L Tris-HCl，內(nèi)含150mmol/L NaCl，pH 8.0，控制流速為0.5m L/m in。收集各洗脫峰，進(jìn)行抗真菌活性的篩選。

1.2.2 SDS-PAGE測(cè)定分子質(zhì)量

采用SDS-PAGE法[13]測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白為對(duì)照，4%濃縮膠，12.5%分離膠。

1.2.3 真菌生長(zhǎng)抑制活性測(cè)定

采用牛津杯法[14]測(cè)定各層析組分的真菌生長(zhǎng)抑制活性，受檢真菌為鏈格孢霉(Alternaria alternate)、綠色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)。將供試菌株點(diǎn)植于PDA培養(yǎng)基中心，于28℃培養(yǎng)至菌落直徑達(dá)到1～2cm，在距離菌落邊緣1cm處放置滅菌的牛津杯，各取200μL樣品組(含目的蛋白)和對(duì)照組(不含目的蛋白，其他條件完全相同的緩沖液)，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后加入牛津杯內(nèi)，4℃預(yù)擴(kuò)散24h，28℃繼續(xù)培養(yǎng)72h，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 薏苡種子抗真菌蛋白的純化結(jié)果

薏苡種子水溶性總蛋白經(jīng)Resource S陽(yáng)離子交換柱分離，得到6個(gè)蛋白洗脫峰(圖1)。經(jīng)檢測(cè)，峰Ⅲ具有抗真菌活性，將峰Ⅲ上樣于Superdex 75 10/300 GL層析柱進(jìn)一步分離，得到兩個(gè)洗脫峰(圖2)，經(jīng)測(cè)定，峰Ⅰ具有抗真菌活性。

圖1 薏苡種子抗真菌蛋白的Resource S陽(yáng)離子交換層析Fig.1 Cation exchange Resource S cation exchange column chrom atography for the protein from ad lay seeds

圖2 陽(yáng)離子交換層析活性洗脫峰Ⅲ的Superdex 75凝膠排阻層析Fig.2 Size exclusion chromatographic of fraction III obtained in Resource S cation exchange column fraction on Superdex Pep tide HR 10/300 column

2.2 抗真菌蛋白分子質(zhì)量測(cè)定

圖3 薏苡種子抗真菌蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of purified antifungal p rotein from ad lay seeds

采用SDS-PAGE法測(cè)定薏苡種子抗真菌蛋白的分子質(zhì)量，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)目的蛋白的相對(duì)遷移率，得出其分子質(zhì)量約為28kD。電泳結(jié)果(圖3)顯示，與薏苡種子水溶性總蛋白(泳道1)相比，目的蛋白(泳道2)得到了高度純化，其表觀純度大于95%。

2.3 真菌生長(zhǎng)抑制活性檢測(cè)

圖4 薏苡種子抗真菌蛋白對(duì)3株真菌生長(zhǎng)抑制的劑量依賴性實(shí)驗(yàn)Fig.4 Effect of P antifungal protein aging

由圖4可知，目的蛋白可明顯抑制供試霉菌的生長(zhǎng)。由于抗真菌蛋白的抑制作用，兩株主要依靠菌絲延伸增殖的霉菌，鏈格孢霉和白腐菌(圖4A、C)，在菌落邊緣形成類似弦月的抑制形態(tài)(圖4A-1和圖4C-2)。綠色木霉(圖4B)依靠孢子增殖，菌絲可以繞過(guò)抗真菌蛋白的抑制區(qū)繼續(xù)擴(kuò)散，抑制區(qū)的菌落形成了一個(gè)類似抑菌圈的抑制形態(tài)(圖4B)，隨著用樣量的增大，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴效應(yīng)，而在相同條件下，對(duì)照組(圖4B-0)菌絲擴(kuò)散沒(méi)有受到影響，菌落邊緣呈現(xiàn)規(guī)則的圓形。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Resource S陽(yáng)離子交換層析和Superdex 75凝膠排阻層析，從薏苡種子中純化出一種可以抑制鏈格孢霉(Alternaria a lternate)、綠色木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)生長(zhǎng)的抗真菌蛋白。

目前，由于抗生素的大量使用，耐藥菌株和多重耐藥菌株不斷增加，使抗感染治療成為難題。隨著社會(huì)的進(jìn)步，多種添加劑因?yàn)椴环闲碌陌踩蠖煌Ｖ故褂?。植物種子來(lái)源的抗真菌蛋白因來(lái)源廣泛，抗菌譜廣，不易產(chǎn)生抗藥性，無(wú)毒副作用[15]等特點(diǎn)，在新型藥物開發(fā)、食品添加劑、化妝品和保健食品等方面有廣闊的開發(fā)前景[16]。本實(shí)驗(yàn)以薏苡種子為研究對(duì)象，獲得了一種新的薏苡28kD抗真菌蛋白，對(duì)3株常見的農(nóng)業(yè)致病真菌有顯著的生長(zhǎng)抑制作用。該蛋白的結(jié)構(gòu)特征以及是否具有抗腫瘤作用正在進(jìn)一步研究中。本研究建立的薏苡抗真菌蛋白提取技術(shù)簡(jiǎn)單，目的蛋白純度較高，為進(jìn)一步研究其抗病機(jī)理及植物原添加劑應(yīng)用于農(nóng)作物保護(hù)和食品工業(yè)領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and Antifungal Properties of a New Protein from Adlay Seeds (Coix chinensis)

LI Chen，BAI Cheng-zhi，LI Yu-ying，WANG Zhuan-hua*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

A protein from adlay (Coix chinensis) seeds was isolated by degrease with acetone and ether, extraction with 20 mmol/L Tris-HCl buffer, ion exchange chromatography on Resource S column and size exclusion chromatography on Superdex 75 column. The purity was higher than 95%. Partial characterization and antifungal activity were assayed. The protein exhibited a molecule mass of 28 kD in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. This protein could exert potent inhibitory activity toward fungal species includingAlternaria alternate,Trichoderma reeseiandPanus conchatusin a dose-dependent pattern. Antifungal protein has become a popular research topic because of their resistance to pathogenic diseases. In this paper, the studies have demonstrated that adlay seeds have potentially exploitable significance and explored an effective method for the isolation and purification of antifungal proteins from plant seeds.

adlay seeds；antifungal protein；purification

Q516

A

1002-6630(2012)05-0046-03

2011-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30970611；31171659)；山西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20100321101)

李晨(1981—)，女，博士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：lichen@sxu.edu.cn

*通信作者：王轉(zhuǎn)花(1956—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锘蚬こ膛c蛋白質(zhì)工程。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn