遲春萍，時成波，曹玉鋒，陳子楊，徐 軍，張健鋒，賈 媛，李 錚，王小杰，牛 靈，田海山，孫 彪，李校堃,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.長春生物制品研究所，吉林 長春 130062；3.中國科學(xué)院 微生物研究所，北京 100080；4.四平華科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林 四平 136000)

構(gòu)建人Cu,Zn-SOD畢赤酵母轉(zhuǎn)化子及其高表達研究

遲春萍1,2，時成波2，曹玉鋒2，陳子楊2，徐 軍2，張健鋒2，賈 媛2，李 錚2，王小杰1，牛 靈3，田海山1，孫 彪4，李校堃1,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.長春生物制品研究所，吉林 長春 130062；3.中國科學(xué)院 微生物研究所，北京 100080；4.四平華科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林 四平 136000)

設(shè)計人Cu,Zn-SOD酵母偏愛密碼子并化學(xué)合成，與pPIC9K連接，構(gòu)建酵母偏愛密碼子的人Cu,Zn-SOD基因真核表達載體，通過電轉(zhuǎn)化和持續(xù)加壓篩選畢赤酵母GS115高拷貝轉(zhuǎn)化子，獲得的重組高表達酵母菌株建立主種子批。經(jīng)Southern blot鑒定，基因拷貝數(shù)提高2～8倍，活性檢測顯示提高2～4倍。重組菌的目的基因拷貝數(shù)與表達產(chǎn)物呈正相關(guān)；表達產(chǎn)物為二聚體，其分子質(zhì)量為40kD左右，低糖基化，均為分泌表達。Western blot法分析，對Cu,Zn-SOD抗體具有特異性反應(yīng)。轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)16h后進入對數(shù)生長期，24h后進入生長穩(wěn)定期；轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)20h左右進行誘導(dǎo)表達最為合適。高拷貝的3株重組菌經(jīng)50次傳代后插入的目的基因保持穩(wěn)定；Cu,Zn-SOD轉(zhuǎn)化子用正交試驗篩選搖瓶的誘導(dǎo)表達條件，經(jīng)誘導(dǎo)表達，Cu,Zn-SOD表達上清最高活性大于600U/mL。確立最適搖瓶培養(yǎng)條件為pH6.0、30℃、體積分數(shù)1.5%甲醇誘導(dǎo)72h測得上清的目的蛋白表達最好，表明構(gòu)建了高表達菌株。

畢赤酵母GS115；Cu,Zn-SOD；電轉(zhuǎn)化法；高拷貝；真核表達

自1969年，美國科學(xué)家McCord和Fridivich從牛血中發(fā)現(xiàn)并提取出具有防病、抗衰、提高免疫力以及美容功能的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)[1]。目前生產(chǎn)SOD有3種方法[2]：動物血提取、各種植物提取、基因工程菌中提取。由于動物源的SOD難以清除各種病毒，歐洲已從1999年頒布禁令：禁止動物血SOD用于人類。植物源的SOD同樣存在外源污染、蛋白種屬差異、免疫排斥、過敏反應(yīng)等問題。國際SOD的最新發(fā)展是用基因重組法生產(chǎn)rhSOD，這是SOD領(lǐng)域的世界前沿技術(shù)。應(yīng)用基因工程方法提取的SOD，不涉及有機溶劑處理，故產(chǎn)品無任何有機試劑殘留，具有無外源性污染、無病毒殘存、無蛋白種屬差異、無免疫排斥、無過敏反應(yīng)，從根本上解決了人類使用SOD的安全問題[3-4]。

本實驗室人工合成出畢赤酵母偏愛的人銅鋅超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)基因，通過電轉(zhuǎn)化后采取G418加壓篩選方法，先后構(gòu)建4株轉(zhuǎn)化子并進行表達分析比較。高拷貝轉(zhuǎn)化子建立的主種子批為rhSOD的中試工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

畢赤酵母GS115、大腸桿菌(DH5α)由本實驗室保存。

Cu,Zn-SOD單抗 本實驗室制備；限制性內(nèi)切酶Sal I、SnaB I和Not I及T4連接酶 英國Bio Labs公司；引物 紫金公司合成；DNA質(zhì)粒提取試劑盒、DNA MarkerDL2000、G418活性檢測試劑盒等 寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JS-680B型凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；PTC-1196型PCR擴增儀 美國MJ Research公司；TGL-16G高速臺式離心機 上海醫(yī)用分析儀器廠；V-2102PC型紫外-可見分光光度計 上海Unico公司；PHS-3C酸度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；CS-930薄層掃描儀日本島津公司；蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀及斑點雜交加樣器美國Bio Rad公司。

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10、蛋白胨20、氯化鈉0.5、瓊脂粉15，葡萄糖2mmol/L，蒸餾水1000mL；BMGY培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10、蛋白胨20、葡萄糖20、酵母含氮堿基1.34、生物素0.04、甘油10，磷酸鹽緩沖液10mmol/L (pH6.0)，蒸餾水1000mL；BMMY培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10、蛋白胨20、硫酸銅0.08、硫酸鋅0.0016、葡萄糖20、酵母含氮堿基1.34、生物素0.04、甘油10，磷酸鹽緩沖液10mmol/L (pH6.0)，甲醇1.5%，蒸餾水1000mL。

1.4 構(gòu)建pPIC9K/Cu,Zn-SOD載體

選定NCBI中的Cu,Zn-SOD 465個基因并將其密碼子更換為酵母偏愛的密碼子，兩端加入SnaB I和Not I兩個酶切位點并化學(xué)合成之。目的基因與pPIC9K用T4連接酶連接，pPIC9K/Cu, Zn-SOD用BglⅡ線性化后轉(zhuǎn)化至DH5α中。

1.5 構(gòu)建GS115/Cu,Zn-SOD、pPIC9K轉(zhuǎn)化子

將DH5α/pPIC9K/Cu,Zn-SOD及DH5α/pPIC9K挑單顆，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒并并純化后用BglⅡ線性化，以25μF電容，200Ω電阻選用1.5、1.8kV及2.2kV 3種電壓電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)畢赤酵母GS115細胞，觀察各組電轉(zhuǎn)參數(shù)轉(zhuǎn)化效率。陽性轉(zhuǎn)化子用PCR篩選鑒定，設(shè)計引物序列為：AOX1上游引物：5＇-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3＇，AOX1下游引物：5＇-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3＇。

1.6 高拷貝GS115/Cu,Zn-SOD轉(zhuǎn)化子的篩選

用最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)電穿孔轉(zhuǎn)化GS115菌株，將得到的1136個菌落依次接種在0.3～4.0mg/mL不同G418質(zhì)量濃度的YPD平板上。在耐受高質(zhì)量濃度G418篩選陽性高拷貝轉(zhuǎn)化子。

1.7 Southern blot法檢測轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)量

制備雜交探針[5]：PCR擴增重組菌SOD基因，擴增的產(chǎn)物回收純化，純化產(chǎn)物依DIG試劑盒進行DIG隨機引物法標(biāo)記。

Southern blot[5]：以相同OD600nm值培養(yǎng)液等體積提取4株陽性轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，等量點于硝酸纖維素膜上，烤干后進行雜交顯色，實驗重復(fù)2次。

1.8 目的基因在轉(zhuǎn)化子中的傳代穩(wěn)定性檢測

將1#、2#、3#3株轉(zhuǎn)化子在YPD平板上傳50代，提取基因組DNA，PCR鑒定目的基因。

1.9 重組酵母菌株生長曲線的測定

陽性轉(zhuǎn)化子按1:100的接種量接種菌液到BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，每2h測定菌體密度，以O(shè)D600nm值對時間作圖，繪制重組酵母菌株GS115/pPIC9K-SOD的生長曲線。

1.10 重組酵母菌株誘導(dǎo)表達及產(chǎn)物分析

挑GS115/pPIC9K、GS115空白菌及重組酵母菌到5mL BMGY培養(yǎng)基中，OD600nm值約6左右轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)，每24h補加100%甲醇使其終體積分數(shù)為1%。在不同時間點收集離心沉淀和上清，上清液用活性檢測試劑盒檢測活性，表達120h后上清20倍濃縮，非變性及變性電泳檢測表達產(chǎn)物，用Cu,Zn-SOD單克隆抗體進行Western blot分析，考馬斯亮藍法測定培養(yǎng)上清的蛋白含量[6]。

1.11 重組酵母菌株搖床表達條件的優(yōu)化

挑GS115/pPIC9K-Cu,Zn-SOD轉(zhuǎn)化子的單菌落至10mL YPD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)過夜，當(dāng)OD600nm值達6時按1%接種量接種于裝有100mL BMGY培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，30℃繼續(xù)培養(yǎng)，18h后離心轉(zhuǎn)至同體積的不同pH值的BMMY誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基中，用不同溫度進行誘導(dǎo)表達，分別在每24h留樣檢測并添加甲醇至不同終濃度。用試劑盒檢測rhCu,Zn-SOD活性及考馬斯亮藍檢測蛋白含量，在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，按四因素三水平正交設(shè)計進行試驗，每組重復(fù)3次，見表1。

表1 Cu,Zn-SOD酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達正交試驗設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal test for technological optimization of rhCu,Zn-SOD expression in GS115/pPIC9K-SOD

1.12 誘導(dǎo)表達4株重組SOD酵母菌

用最適誘導(dǎo)表達條件，即30℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH6.0，每24h補加100%甲醇稀釋至1.5%甲醇，用活性檢測試劑盒檢測表達上清的活性，電泳法及考馬斯亮藍法檢測上清的蛋白表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建pPIC9K/Cu,Zn-SOD載體

圖1 pPIC9K/Cu,Zn-SOD載體構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction of pPIC9K/Cu,Zn-SOD vector

如圖1所示，465bp的Cu,Zn-SOD與9276bp的pPIC9K鏈接后，構(gòu)建長度為9741bp的pPIC9K/Cu,Zn-SOD。

圖2 pPIC9K/SOD酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of pPIC9K/SOD by restriction enzyme

由圖2可知，pPIC9K/Cu, Zn-SOD質(zhì)粒經(jīng)SnaB I和Not I雙酶切后電泳觀察到9.3kb和0.45kb兩個特異性條帶，與預(yù)期片段長度一致，表明Cu,Zn-SOD表達載體構(gòu)建成功。

2.2 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母細胞的轉(zhuǎn)化效率

電轉(zhuǎn)時電壓和電阻的設(shè)置對電轉(zhuǎn)化效果的影響很大，所以優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)可以提高轉(zhuǎn)化效率，采用3組(第一組：25μF電容；200Ω電阻1.5kV電壓；第二組：25μF電容；200Ω電阻1.8kV電壓；第三組：25μF電容；200Ω電阻2.2kV電壓)電轉(zhuǎn)參數(shù)。從圖3可知，轉(zhuǎn)化效率隨電壓的遞增而增加。

圖3 3組電轉(zhuǎn)參數(shù)轉(zhuǎn)化酵母細胞的轉(zhuǎn)化效率Fig.3 Pichia pastoris transformation efficiency of under three different electrical voltages

2.3 GS115/Cu,Zn-SOD轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建及檢定

以酵母的染色體作為模板，以Pichia pastoris外源基因插入部位兩端的序列3＇-AOX1和5＇-AOX1為上下游引物，進行PCR擴增分析，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)染了pPIC9K-SOD的酵母基因組染色體進行PCR擴增，在約1 0 0 0 b p左右處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期一致(465bp+492bp)，轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒pPIC9K的酵母基因組染色體PCR擴增，作為對照，在約500bp處出現(xiàn)明亮的條帶，與設(shè)計492bp大小一致?？召|(zhì)粒pPIC9K酵母PCR擴增，未見基因條帶，說明實驗方法成立，目的基因SOD已整合到了酵母染色體上。先后成功構(gòu)建4株轉(zhuǎn)化子，分別命名為0#、1#、2#、3#。

圖4 pPIC9K/SOD的PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of rhCu,Zn-SOD gene in genomic DNA of recombinant yeast by PCR

2.4 轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)檢測

兩次基因雜交結(jié)果經(jīng)凝膠成像分析(圖5)顯示：1#、2#、3#菌株的目的基因拷貝數(shù)分別約為0#菌株的2、8倍和6倍。

圖5 重組酵母菌株的基因雜交圖譜Fig.5 Determination of rhCu,Zn-SOD gene copy number in recombinant yeast by Southern blot

2.5 轉(zhuǎn)化子傳代后的基因穩(wěn)定性檢測

圖6 PCR鑒定重組酵母菌株Fig.6 Identification of rhCu,Zn-SOD gene in genomic DNA of recombinant yeast after passages

將1#、2#、3#陽性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，用轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pPIC9K作為對照。結(jié)果如圖6所示，3株轉(zhuǎn)化子菌株的基因組在傳代前及傳代后均能擴增出大小為957bp的片段，轉(zhuǎn)染的空質(zhì)粒pPIC9K擴增出大小為492bp的基因片段。說明pPIC9K-SOD已經(jīng)穩(wěn)定整合到酵母基因組中。將該3株菌株(1#、2#、3#)凍干保存，建立中試用主種子批。

2.6 重組酵母菌株生長曲線的測定

圖7 GS115/pPIC9K-SOD生長曲線Fig.7 The growth curve of recombinant yeast

如圖7所示，重組菌株在培養(yǎng)16h后進入對數(shù)生長期，24h后進入生長穩(wěn)定期。重組菌株在培養(yǎng)20h左右進行誘導(dǎo)表達最為適宜。

2.7 重組酵母菌株誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的分析

圖8 重組酵母菌株誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的免疫印跡Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant rhCu,Zn-SOD protein

重組酵母菌株誘導(dǎo)表達非變性電泳結(jié)果如圖8a所示，第1,泳道在40kD處可見明顯目的蛋白帶，用薄層掃描儀分析樣品中目的蛋白含量占總蛋白的48.2%，活性為523U/mL，蛋白含量為102μg/mL，變性電泳(圖8b)可見目的蛋白約為20kD，比理論值(16kD)高些，應(yīng)為低糖基化的表達蛋白，1～4泳道變性電泳顯示轉(zhuǎn)染pPIC9K及pPIC9K-Cu,Zu-SOD的重組酵母菌細胞中未見分子質(zhì)量20kD的蛋白帶，轉(zhuǎn)染pPIC9K酵母菌及空菌的誘導(dǎo)表達上清也未見2 0 k D的蛋白帶，只能轉(zhuǎn)染了pPIC9K-Cu,Zu-SOD重組酵母菌誘導(dǎo)表達上清可見20kD的目的蛋白帶，表明該構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子成功實現(xiàn)了分泌表達。Western blot分析表達上清，可見有特異性性反應(yīng)條帶。

2.8 重組酵母菌株表達條件的優(yōu)化結(jié)果

表2 重組酵母菌株表達條件的正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表2直觀分析可見，第5號試驗組條件下測得的蛋白表達量及蛋白活性最高，即重組畢赤酵母GS115/Cu,Zn-SOD在誘導(dǎo)溫度為30℃，pH6.0并用1.5%甲醇誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)72h得到的結(jié)果優(yōu)于其他8個試驗號，所以最佳因素組合為A2B2C3D1。由極差可知，影響重組菌株表達條件的因素順序為A＞D＞B＞C，甲醇的誘導(dǎo)體積分數(shù)影響因素最大，這也印證了甲醇是AOX1啟動子的誘導(dǎo)表達的重要因素，即在沒有甘油等碳源的情況下，酵母因有AOX1啟動子而啟動甲醇代謝途徑。

2.9 誘導(dǎo)表達4株重組酵母菌結(jié)果

圖9 rhCu,Zn-SOD重組酵母菌變性及非變性電泳Fig.9 SDS-PAGE analysis of rhCu,Zn-SOD protein from 4 recombinant yeast strains

由SDS-PAGE變性及非變性電泳可見構(gòu)建的重組酵母菌表達產(chǎn)物為分子質(zhì)量約20kD單體及約40kD的二聚體，沉淀中未見與分子質(zhì)量相同的目的蛋白條帶(圖9)，比較構(gòu)建的4株轉(zhuǎn)化子活性及表達量結(jié)果為2#＞3#＞1#＞0#(表3)。表明構(gòu)建的工程菌株的分泌產(chǎn)物表達量及其活性與目的基因拷貝數(shù)均呈正相關(guān)。

表3 4株轉(zhuǎn)化子表達上清酶活性測定及蛋白表達量Table 3 Determination of supernatant SOD activity and protein yield of 4 recombinant yeast strains

3 結(jié)論與討論

Marn等[7]1938年從牛紅血球中分離獲得氧化物歧化酶(SOD)，SOD的研究歷史已有70年之久。實驗證實其催化原理是將底物超氧陰離子自由基催化為過氧化氫和氧氣[8-9]。按酶分類，SOD屬于金屬酶，根據(jù)所含金屬輔基的不同，可以將其分為3類：第一類存在于真菌和哺乳動物的真核細胞中[10]，也存在原核生物如Haemophilus influenzae和Caulobacter crescentus[11]中的Cu,Zn-SOD；第二類存在于E.coli[12-13]和Methanobacterium bryanti[14]等原核生物內(nèi)的含F(xiàn)e離子的SOD(Fe-SOD)；第三類存在于真核生物細胞線粒體和原核生物E.coli[15]的細胞內(nèi)的含有二價Mn離子的SOD(Mn-SOD)。Cu,Zn-SOD的穩(wěn)定性及含量高于Mn-SOD，使之在臨床應(yīng)用成為可能，又因異種SOD在臨床上易過敏，故本研究選擇人的SOD。

畢赤酵母P.pastoris為真核表達系統(tǒng)，遺傳穩(wěn)定，重組表達產(chǎn)物背景雜蛋白少，適于高密度培養(yǎng)表達，是一種較為理想的真核蛋白表達系統(tǒng)。帶有分泌信號肽的畢赤酵母pPIC9K載體可將外源蛋白基因整合到畢赤酵母的基因組中，從而實現(xiàn)目的蛋白得分泌表達[16]。畢赤酵母中外源基因的來源對表達有很大影響，用酵母偏愛密碼子編碼外源基因，對于篩選高表達菌株具有較好的實踐意義。采用酵母偏愛密碼子合成人Cu,Zn-SOD在酵母中表達，國內(nèi)外還沒有報道。國外對SOD的突變體研究較多，但都在臨床階段，國內(nèi)表達雖有研究，但報道不多且表達量也不能達到產(chǎn)業(yè)化要求。

本研究表明拷貝數(shù)與表達量呈正相關(guān)。理論上，提高拷貝數(shù)可增加外源蛋白的表達水平[17-18]。但在個別情況下，高拷貝數(shù)不利于目的蛋白的表達，這可能是由于負反饋抑制作用使分泌的蛋白因過高表達而對分泌途徑形成抑制作用。故表達量的高低與基因拷貝數(shù)的關(guān)系只有從實驗中得到結(jié)論[19-23]。

酵母菌在對數(shù)生長期時，生長速率最大，細胞內(nèi)酶系活躍，代謝旺盛，大量蛋白得以表達。因此，酵母先在BMGY中快速生長，當(dāng)處于對數(shù)生長期時，轉(zhuǎn)到BMMY中進行甲醇誘導(dǎo)，更有利于外源蛋白的大量表達。從重組菌株的生長曲線看出，酵母菌在BMGY中培養(yǎng)16～24h處于對數(shù)生長期，在此期間更換BMMY培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)最為合適。本研究構(gòu)建的3株高拷貝轉(zhuǎn)化子，實現(xiàn)了目的蛋白的高表達，為進一步探索積累了實驗數(shù)據(jù)。

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Construction and High Expression of Pichia pastoris Transformants Carrying Human Cu/Zn Superoxide Dismutase Gene

CHI Chun-ping1,2，SHI Cheng-bo2，CAO Yu-feng2，CHEN Zi-yang2，XU Jun2，ZHANG Jian-feng2，JIA Yuan2，
LI Zheng2，WANG Xiao-jie1，NIU Ling3，TIAN Hai-shan1，SUN Biao4，LI Xiao-kun1,*(1. School of Life Sciencs, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Changchun Institute of Biological Products,Changchun 130062, China；3. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Beijing 100080, China；4. Siping Huake Biotechnology Limited Company, Siping 136000, China)

Artificial rhCu,Zn-SOD gene was synthesized according to the amino acid sequence of human SOD with yeast preferential codons, then cloned into the eukaryotic expression vector pPIC9K, named pPIC9K/Cu,Zn-SOD. The plasmid was transformed into Pichia pastoris GS115 by electroporation and screened for high-copy transformants under the selective pressure.Three recombinant yeast strains were obtained with high expression. Gene copy number increased 2－8 folds by Southern blot identification. The expression activity increased 2－4 fold. The recombinant gene copy number was positively correlated with the SOD protein yield. The Expressed protein was secreted to the supernatant as dimmer with low degree of glycosylation. The molecular weight was about 40 kD. The product can specificity bind to the antibody of Cu,Zn-SOD. Transformants entered the logarithmic growth phase after 16 h and the stable growth phase after 24 h in culture. After 50 passages, 3 recombinant strains remained stable, indicating it could be used for industrialization production of Cu,Zn-SOD. Cu,Zn-SOD activity was determined as 600U/mL in supernatant. The high expression strain was build after the optimal shake flask culture conditions of pH 6.0,temperature 30 ℃, 1.5%(V/V) ethanol, and 72h induced.

Pichia pastoris GS115；Cu,Zn-SOD；electrotransformation；high gene copy number；ereukaryotic expression

Q78

A

1002-6630(2012)05-0218-06

2011-04-29

吉林省科學(xué)技術(shù)發(fā)展重點項目(20070924-02)

遲春萍(1963—)，女，副研究員，博士研究生，主要從事基因工程藥物研究。E-mail：chichunping@163.com

李校堃(1964—)，男，教授，博士，主要從事生物反應(yīng)器與基因藥物研究。E-mail：xiaokunli@163.net