包 榮，李 榮，譚 津，姜子濤*

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134)

鈦膠柱反相高效液相色譜法測(cè)定飲料中的阿斯巴甜

包 榮，李 榮，譚 津，姜子濤*

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134)

建立基于鈦膠柱對(duì)無糖可樂中甜味劑阿斯巴甜的高效液相色譜快速測(cè)定方法。色譜條件：分離柱為Titania Sachtopore-RP柱(250mm×4.6m，5μm)，柱溫70℃，流動(dòng)相為V[15mmol/L磷酸銨緩沖溶液，(NH4)2HPO4:NH4H2PO4＝6:4；10mmol/L氟化銨]-V(甲醇)＝70:30，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)217nm。線性范圍為10～2500μg/mL，最低檢出限為0.08μg/mL，回收率為92.5%～97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝8)小于0.72%。本法準(zhǔn)確度和精密度均可滿足飲料中阿斯巴甜的測(cè)定要求。

阿斯巴甜；鈦膠柱；高效液相色譜法；無糖可樂

阿斯巴甜(aspartame)又名甜味素、天冬甜母、天冬甜精，學(xué)名稱為天門冬酰苯丙氨酸甲酯(分子式為C14H18N2O5，相對(duì)分子質(zhì)量為294.31)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 阿斯巴甜的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of aspartame

阿斯巴甜的甜味特征幾乎與蔗糖相同，較純正，甜度是蔗糖的200倍[1]。阿斯巴甜在干燥狀態(tài)下較穩(wěn)定，在溶液中的穩(wěn)定性受pH值、溫度和放置時(shí)間的影響較大[2]。溶液pH值在3～6時(shí)，其穩(wěn)定性良好，pH＜3時(shí)易水解成天冬氨酰苯丙氨酸，當(dāng)pH＞6時(shí)易環(huán)化生成苯甲基-3,6-雙氧-2-哌嗪乙酸。在室溫下，當(dāng)pH值為4.3時(shí)最為穩(wěn)定，半衰期約為300d。在pH7的環(huán)境下，其半衰期則僅有數(shù)天。然而大部分飲料的pH值都介于2.36～3.98間[3]，所以添加在飲料中的阿斯巴甜均很穩(wěn)定。1967年美國將其作為甜味劑使用。目前已有包括中國和美國在內(nèi)的80多個(gè)國家允許將阿斯巴甜應(yīng)用于除罐頭食品外的所有食品，其用量按生產(chǎn)需要適量使用[4]。因阿斯巴甜甜味高和熱量低，主要添加于飲料、維他命含片或口香糖代替糖的使用。許多糖尿病患者、減肥人士都以阿斯巴甜作為糖的代用品。但阿斯巴甜受溫容易分解而失去甜味，不適用于熱加工食品。另外，由于苯酮尿癥患者無法代謝苯丙氨酸等含苯環(huán)類的氨基酸，因此需避免接觸阿斯巴甜。

目前，全球阿斯巴甜的年消費(fèi)增長(zhǎng)率已超過20%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他人工合成甜味劑平均增長(zhǎng)率5%的速度。但目前國際上對(duì)阿斯巴甜的安全性存在很大爭(zhēng)議，多國研究人員動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了阿斯巴甜對(duì)人體有害，并呼吁阿斯巴甜下架。但也有人認(rèn)為，阿斯巴甜能致人患腫瘤這一說法缺乏科學(xué)依據(jù)[5]。無論如何，阿斯巴甜作為一種食品添加劑，其應(yīng)用范圍正逐漸擴(kuò)大，為避免其對(duì)人體的潛在危害，添加量應(yīng)受到嚴(yán)格監(jiān)控，為此有必要完善在食品中快速檢測(cè)阿斯巴甜含量的方法。關(guān)于阿斯巴甜含量的測(cè)定方法已有氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[5,7-12]和毛細(xì)管電泳法[12-15]方面的報(bào)道。但由于硅膠ODS柱本身固有的“第二效應(yīng)”的存在，常常導(dǎo)致阿斯巴甜色譜峰對(duì)稱性差，影響分離效率，色譜柱壽命降低。

鈦膠基質(zhì)固定相是近年發(fā)展起來的新型色譜填料，其具有傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)固定相不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，不存在硅膠固定相對(duì)堿性化合物存在“不可逆吸附”的致命缺陷。并且鈦膠具有極好的化學(xué)穩(wěn)定性，在pH1～14的范圍內(nèi)都是非常穩(wěn)定的，而硅膠固定相則僅僅適用于pH3～9的范圍內(nèi)。在現(xiàn)在的研究中，將應(yīng)用鈦膠基質(zhì)C18作為固定相，建立鈦膠柱反相高效液相色譜法測(cè)定飲料中阿斯巴甜的新方法，并應(yīng)用于無糖可樂樣品中阿斯巴甜的含量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

無糖可樂 市購；阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品(aladdin，99.0%)，配制成2.5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液：稱取0.125g阿斯巴甜置于50mL容量瓶中，用純凈水(H3PO4調(diào)至pH4.3)溶解并定容至刻度，置于冰箱備用。甲醇(色譜純)、磷酸氫二銨(色譜純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氟化銨(色譜純)、磷酸二氫銨(色譜純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1200系列高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；鈦膠基質(zhì)C18反相色譜柱(Sachtopore-RP，5μm diameter，300A°pore size，250mm × 4.6mm i.d.) 美國 Zirchrom 公司；FA1104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 色譜條件

流動(dòng)相為V[15mmol/L磷酸銨緩沖溶液，(NH4)2HPO4:NH4H2PO4＝6:4；10mmol/L氟化銨]-V(甲醇)＝70:30，等梯度洗脫流速1.0mL/min，柱溫70℃，紫外波長(zhǎng)掃描范圍200～400nm。以保留時(shí)間和紫外吸收譜圖定性，峰面積定量。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取2.5mg/mL阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別稀釋為10、50、100、200、500、800、1000μg/mL，依次取20μL進(jìn)樣，以阿斯巴甜質(zhì)量濃度/(μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算線性回歸方程。

1.4 樣品測(cè)定

取適量不同品牌的市售無糖可樂樣品，超聲脫氣后，準(zhǔn)確量取1mL的樣品放入10mL比色管中，稀釋至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣20μL。根據(jù)阿斯巴甜色譜峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣液中的阿斯巴甜質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用紫外分光光度計(jì)對(duì)稀釋后可樂樣品在200～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，由掃描結(jié)果可知：阿斯巴甜的最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在217nm，故后面的測(cè)定中選擇色譜UV檢測(cè)器的波長(zhǎng)為217nm。阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖2。

圖2 阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of aspartame standard

2.2 柱溫選擇

經(jīng)考察，柱溫對(duì)半峰寬及保留時(shí)間影響顯著。保持流動(dòng)相其他條件不變，改變柱溫，分別為25、40、50、60、70℃。結(jié)果顯示，隨柱溫增大柱效不斷提高，見圖3。為達(dá)到阿斯巴甜的最佳分離，實(shí)驗(yàn)選擇柱溫70℃。之所以沒有繼續(xù)提高溫度，因有資料顯示阿斯巴甜在80℃左右會(huì)有部分分解，同時(shí)色譜流動(dòng)相的產(chǎn)氣現(xiàn)象會(huì)較明顯。

圖3 塔板數(shù)與柱溫的關(guān)系Fig.3 Effect of column temperature on the number of plates

2.3 流動(dòng)相中磷酸鹽濃度的選擇

分別選取流動(dòng)相中磷酸鹽的濃度為5、10、15mmol/L和17mmol/L進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示，隨磷酸鹽濃度增大，峰寬及保留時(shí)間均減小，因此，選擇磷酸鹽濃度最佳條件15mmol/L。磷酸鹽濃度過小，阿斯巴甜峰展寬現(xiàn)象比較嚴(yán)重；磷酸鹽濃度過大時(shí)，阿斯巴甜保留時(shí)間短，溶劑峰及其他保留值較小的物質(zhì)易產(chǎn)生干擾。

圖4 半峰寬(A)、保留時(shí)間(B)與磷酸鹽濃度的關(guān)系Fig.4 Effect of ammonium phosphate buffer concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.4 流動(dòng)相pH值的選擇

改變流動(dòng)相中緩沖液的pH值，即(NH4)2HPO4和NH4H2PO4的比例分別為3:7、1:1、6:4、7:3和8:2，之后用于阿斯巴甜的色譜分析。結(jié)果表明，(NH4)2HPO4:(NH4)H2PO4越大，即pH值越大，峰寬和保留時(shí)間越小，見圖5。選擇最佳條件(NH4)2HPO4:(NH4)H2PO4＝6:4。若此比例繼續(xù)增大，峰寬會(huì)減小，但保留時(shí)間過短不易與雜質(zhì)分離。

圖5 半峰寬(A)、保留時(shí)間(B)與磷酸鹽比例的關(guān)系Fig.5 Effect of ammonium phosphate composition on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.5 流動(dòng)相中氟化銨濃度的選擇

分別選取5、10、12、15mmol/L考察氟化銨濃度對(duì)分析效果的影響。結(jié)果顯示，隨氟化銨濃度增大，峰寬及保留時(shí)間增大，增大至10mmol/L后，曲線趨于平滑，影響較小，見圖6。選擇氟化銨濃度最佳條件10mmol/L，濃度較小時(shí)，保留時(shí)間較短易產(chǎn)生干擾。

圖6 半峰寬(A)、保留時(shí)間(B)與氟化銨濃度的關(guān)系Fig.6 Effect of ammonium fluoride concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.6 流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

固定以上條件，分別配制甲醇體積分?jǐn)?shù)2 0%、30%、40%和50%的溶液。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，阿斯巴甜峰形較寬；40%和50%時(shí)出峰時(shí)間太短，不易與雜質(zhì)分離，見圖7?？梢娫?0%時(shí)，出峰時(shí)間適中，峰形較好，且可與樣品中雜質(zhì)分離，故選用甲醇體積分?jǐn)?shù)為30%。

圖7 半峰寬(A)、保留時(shí)間(B)與甲醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系Fig.7 Effect of methanol concentration on the peak width at half height (A) and retention time (B)

2.7 檢出限及線性范圍

以達(dá)到信噪比3倍的信號(hào)值為最低檢出限，計(jì)算得0.08μg/mL。同時(shí)考察此方法的線性范圍，選取10、50、100、200、500、800、1000μg/mL和2500μg/mL 八個(gè)質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示：當(dāng)阿斯巴甜在10～2500μg/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，線性回歸方程為Y＝177.7034＋15.6243X(R2＝ 0.9994)。

2.8 方法精密度和準(zhǔn)確度

圖8 3種無糖可樂樣品的色譜圖Fig.8 Chromatogram of three diet coke samples

在選定的色譜條件下，分別用200μg/mL和500μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣8次，計(jì)算得準(zhǔn)確度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.72%。在3個(gè)可樂樣品中加入一定量的阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品，與樣品一致處理后進(jìn)樣測(cè)定，樣品測(cè)定結(jié)果及方法回收率見表1，樣品色譜圖見圖8。由表1可見，本法回收率范圍為92.5%～97.4%，平均回收率為95.4%(標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品均平行測(cè)定3次取平均值)。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果和加標(biāo)回收率Table 1 Determination results of samples and spiked recoveries

3 結(jié) 論

鈦膠基質(zhì)色譜固定相為近年來出現(xiàn)的新型色譜填料，其研究和應(yīng)用有待于進(jìn)一步深入，本研究結(jié)果顯示：在最低檢出限、精密度、線性范圍方面鈦膠柱已略見優(yōu)勢(shì)，有較好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)階段鈦膠柱仍存在比表面積較小，柱效較低的缺陷，因此峰形略寬。在此之前雖有流動(dòng)相中不添加緩沖液的報(bào)道，但在鈦膠高效液相色譜測(cè)定的實(shí)際應(yīng)用中，往往存在色譜峰形較差拖尾等現(xiàn)象。本法簡(jiǎn)單易操作、選擇性強(qiáng)、常見成分無干擾、精密度、重現(xiàn)性和回收率較高，適用于無糖可樂及其他食品樣品中阿斯巴甜的定量分析。從經(jīng)濟(jì)角度講，流動(dòng)相采用甲醇-水體系，與乙腈相比節(jié)約成本，適于推廣應(yīng)用。

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Determination of Aspartame in Diet Coke Samples by RP-HPLC on Titania

BAO Rong，LI Rong，TAN Jin，JIANG Zi-tao*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

A method to determine aspartame in diet coke by high performance liquid chromatography on a titania column was described in this paper. The samples were separated on a titania Sachtopore-RP column (250 mm×4.6 mm, 5 μm at 70 ℃ using 15 mmol/L ammonium phosphate buffer ((NH4)2HPO4:NH4H2PO4=6:4) added with 10 mmol/L ammonium fluoride and methanol in the ratio of 70 to 30 as mobile phase. The flow rate was 1 mL/min and the detection wavelength was 217 nm. The linear range of the method was 10－2500 μg/mL with a Detection limit of 0.08 μg/mL. The recoveries of the method were between 92.5%and 97.4%. The relative standard deviation of the method was less than 0.72%. The method is simple, fast, accurate and precise and may be used in the determination of aspartame in drinks.

aspartame；titania；RP-HPLC；sugarless coke

TS207.3

A

1002-6630(2012)10-0150-05

2011-04-26

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(20875069)

包榮(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品添加劑研究。E-mail：hedi572006@126.com

*通信作者：姜子濤(1956—)，男，教授，博士，主要從事食品添加劑與食品分析研究。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn