陶素芬，趙祥穎，劉建軍,,*

(1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；

2.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013)

產(chǎn)單寧酶菌株的篩選及選育

陶素芬1，趙祥穎2，劉建軍1,2,*

(1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；

2.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013)

為得到高產(chǎn)單寧酶的菌株，從多年種植的茶園、柿子園以及掩埋柿子、五倍子和茶葉的花園土壤中通過(guò)平板初篩和三角瓶固體發(fā)酵復(fù)篩篩選到一株產(chǎn)單寧酶的曲霉菌株DNM1-39，固體培養(yǎng)其產(chǎn)單寧酶活力為1.58U/g。以DNM1-39為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線照射、硫酸二乙酯單獨(dú)處理和紫外線照射-硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理，獲得突變株UD-6，其產(chǎn)酶活力達(dá)2.80U/g。連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)酶活力不變，性能穩(wěn)定。

單寧酶；單寧；沒(méi)食子酸；篩選；誘變

單寧酶即單寧酯酰水解酶，它可以水解沒(méi)食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒(méi)食子酸和葡萄糖[1]。單寧酶在食品、啤酒、葡萄酒、飼料加工和精細(xì)化工等行業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用，例如可以用來(lái)處理茶飲料的渾濁及酒類的沉淀，降低它們的澀味，提高它們的感官品質(zhì)，具有高效、無(wú)毒副作用的優(yōu)勢(shì)[2-3]。

生產(chǎn)單寧酶的關(guān)鍵就是要有高產(chǎn)酶能力的菌株，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于這方面的報(bào)道，篩選出的菌多是黑曲霉[4-5]、青霉[6]、細(xì)菌[7-8]，少量的毛霉、根霉[9-10]。高產(chǎn)單寧酶菌種的選育是提高單寧酶產(chǎn)量和質(zhì)量的先決條件。本研究從茶園土壤中篩選單寧酶產(chǎn)生菌，并對(duì)其進(jìn)行物理化學(xué)誘變，以獲得單寧酶產(chǎn)量高、遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣采自日照茶園、柿子園以及筆者掩埋柿子、五倍子和茶葉的花園土壤。茶葉購(gòu)自濟(jì)南某茶葉店，五倍子購(gòu)自濟(jì)南某中藥鋪。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；硫酸二乙酯(DES)等所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[11]：五倍子粉10g、水10mL。平板初篩培養(yǎng)基：蔗糖20g、NaNO33.0g、K2HPO41.0g、MgSO4·7H2O0.5g、KCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、1%溴酚藍(lán) 30mL、單寧 10g、瓊脂 20g、加水定容至1000mL，pH值自然，121℃滅菌20min。 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g，切成小塊，加1000mL水煮沸30min，用雙層紗布濾成清液，加水補(bǔ)充減少的水分，蔗糖 30g、單寧 1.5g、瓊脂 20g、121℃滅菌30min。固體初篩培養(yǎng)基：將麩皮(每100g麩皮添加2g單寧)與鹽溶液(鹽溶液(g/L)：NaCl 1、MgSO4·7 H2O 1、NH4Cl 10)按固液比1:1(m/V)混合均勻，121℃滅菌30min。固體復(fù)篩培養(yǎng)基：同固體初篩培養(yǎng)基。平板完全培養(yǎng)基：蔗糖 2 0 g、N a N O33.0 g、K2H P O41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、單寧10g、瓊脂 20g、加水定容至1000mL，pH值自然，121℃滅菌20min。

1.3 儀器與設(shè)備

GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HG-超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；CHK-BI45光學(xué)顯微鏡 日本日立公司；BH-2 Olympus顯微鏡 日本Olympus Optical公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；HH-S21-4電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；DGB/20-002臺(tái)式干燥箱 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.4 方法

1.4.1 菌株篩選方法

1.4.1.1 平板初篩

取1g土樣，磨碎后加入到富集培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)36h，適當(dāng)稀釋后涂布于平板初篩培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)72h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，將產(chǎn)透明圈較大或使培養(yǎng)基變黃的單菌落轉(zhuǎn)接到斜面保藏培養(yǎng)基上。

1.4.1.2 菌種初篩

每個(gè)250mL三角瓶裝10g固體初篩培養(yǎng)基，以1株接1瓶的方式進(jìn)行接種，30℃恒溫培養(yǎng)72h。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定各株菌發(fā)酵產(chǎn)物的酶活力，選取較高的菌株進(jìn)行下一步的復(fù)篩。

1.4.1.3 菌種復(fù)篩

每個(gè)250mL三角瓶裝10g固體復(fù)篩培養(yǎng)基，以1株接3瓶的方式接種初篩所得菌株，30℃恒溫培養(yǎng)72h，然后測(cè)定各菌株發(fā)酵產(chǎn)物的酶活力。經(jīng)多次復(fù)篩，多次傳代培養(yǎng)，以得到酶活力很高且能穩(wěn)定遺傳的菌株。

1.4.2 單寧酶的浸提

培養(yǎng)結(jié)束后向三角瓶中加入50mL pH5.0的檸檬酸緩沖液，用玻璃棒使固體發(fā)酵基質(zhì)分散，然后置于搖床上，振蕩浸提90min，然后用濾紙過(guò)濾，濾液用于酶活力測(cè)定[11]。

1.4.3 單寧酶活力的測(cè)定[12]

取7支試管，分別為空白管(0)、樣品管(1、2、3)、對(duì)照管(4、5、6)，并依次標(biāo)記。試管中分別加入0.25mL 1mmol/L沒(méi)食子酸丙酯溶液，放入30℃水浴中預(yù)熱5min，然后在空白管中加入0.25mL檸檬酸緩沖液，在樣品管和對(duì)照管中，分別加入0.25mL對(duì)應(yīng)的經(jīng)預(yù)熱后的浸提酶液和沸水浴滅活酶液，再放入30℃水浴中保溫5min。所有試管分別加入0.3mL 0.05mol/L乙醇-繞丹寧溶液，30℃水浴中再保溫5min，再分別加入0.5mol/L的KOH溶液0.2mL，30℃再保溫5min，然后每支試管再加4mL蒸餾水，30℃保溫5min后在520nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度。所有測(cè)定都做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取算術(shù)平均值。酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol沒(méi)食子酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.4.4 菌種誘變

1.4.4.1 孢子懸浮液制備

取培養(yǎng)96h的新鮮斜面培養(yǎng)基，刮取孢子兩環(huán)于裝有玻璃珠和30mL無(wú)菌生理鹽水的250mL三角瓶中，充分打散，過(guò)濾去除菌絲體和成團(tuán)孢子，再用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩遍，加入生理鹽水振蕩，使孢子均勻懸浮在液體中，使孢子濃度控制在108～109個(gè)/mL。

1.4.4.2 紫外線(UV)誘變[13]

20W的紫外燈預(yù)熱20min，取孢子懸液10mL，置于直徑9cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，放置于紫外燈誘變箱內(nèi)，照射距離為30cm，照射時(shí)間分別為60、75、90、105、120、150s，適當(dāng)稀釋后涂布完全培養(yǎng)基的平板，未經(jīng)處理的孢子懸液適當(dāng)稀釋后也涂布完全培養(yǎng)基的平板，30℃恒溫避光培養(yǎng)96h，統(tǒng)計(jì)兩種平板上的菌落數(shù)以及菌落周圍透明圈大小，分別計(jì)算誘變致死率和正突變率。選擇正突變率最高的照射時(shí)間處理篩選獲得的產(chǎn)酶菌株，挑選透明圈直徑和菌落直徑比(D/d)較大的菌落，進(jìn)行固體發(fā)酵初篩、復(fù)篩。并做傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。致死率和正突變率計(jì)算公式如下。

1.4.4.3 硫酸二乙酯誘變[14-15]

吸取50%的硫酸二乙酯-乙醇溶液0.3mL于250mL三角瓶中，加入0.1mol/L pH 5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液5mL和待誘變菌株的孢子懸液5mL，于30℃分別振蕩處理15、30、45、60、75min，處理完畢后加入1mL 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，適當(dāng)稀釋后涂布平板完全培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)96h，計(jì)算誘變致死率和正突變率，選擇最佳處理時(shí)間。

用所選時(shí)間處理待誘變菌株的孢子懸液，挑選透明圈直徑和菌落直徑比(D/d)較大的菌落，進(jìn)行固體發(fā)酵初篩、復(fù)篩。并做傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

1.4.4.4 UV-硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理

吸取孢子懸液9.5mL，置于直徑9cm的無(wú)菌干燥培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中加入50%的硫酸二乙酯-乙醇溶液0.5mL，用20W的紫外燈照射，照射距離30cm，照射一定時(shí)間，適當(dāng)稀釋后涂布于完全培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫避光培養(yǎng)96h，挑選D/d較大的菌落，進(jìn)行固體發(fā)酵初篩、復(fù)篩。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)單寧酶菌株的篩選結(jié)果

從篩選材料中，經(jīng)過(guò)平板初篩共計(jì)得到290株產(chǎn)透明圈的菌株，將上述菌株接種固體發(fā)酵培養(yǎng)，然后測(cè)定各菌株酶活力的大小。通過(guò)3輪篩選，得到30株產(chǎn)酶活力較高的菌株，再以1株接3瓶復(fù)篩得到12株產(chǎn)酶活力高且穩(wěn)定的菌株，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 產(chǎn)單寧酶菌株的篩選Table 1 Screening of tannase-producing strains

由表1可見(jiàn)，分離自茶園土樣的霉菌菌株1-3 9(DNM1-39)產(chǎn)單寧酶活力最高，經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)，該菌株產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，因此選擇該菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶活力。

2.2 菌株DNM1-39的誘變

2.2.1 紫外線照射誘變結(jié)果

圖1 紫外線照射時(shí)間與致死率和正突變率的關(guān)系Fig. 1 Relationships between ultraviolet irradiation time and lethal rate or positive mutation rate

由圖1可以看出，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)致死率逐漸升高直至穩(wěn)定，而正突變率在開始90s內(nèi)呈上升趨勢(shì)，處理時(shí)間再延長(zhǎng)正突變率反而下降，所以選取90s作為紫外線誘變的照射時(shí)間。

將被紫外燈照射90s的菌懸液稀釋涂布分離平板，30℃恒溫培養(yǎng)72h后，選取透明圈較大的183株菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵初篩、復(fù)篩后得到10株的酶活力較高的菌株(表2)，其中酶活力最高的為突變株UV-27，酶活力達(dá)到1.95U/g，是出發(fā)菌株DNM1-39的1.23倍。

表2 紫外線照射誘變菌株篩選結(jié)果Table 2 Mutant strains with high tannase activity induced by ultraviolet irradiation

對(duì)菌株UV-27進(jìn)行傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，傳至第6代，發(fā)酵酶活力仍為1.94U/g，表明該突變株產(chǎn)酶性能穩(wěn)定。為了獲得更高酶活力的菌株，選擇菌株UV-27進(jìn)行下一輪硫酸二乙酯誘變選育。

2.2.2 硫酸二乙酯誘變結(jié)果

圖 2 硫酸二乙酯處理時(shí)間與致死率和正突變率的關(guān)系Fig. 2 Relationships between DES treatment time and lethal rate or positive mutation rate

由圖2可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)致死率逐漸升高，而正突變率在處理時(shí)間為45min時(shí)達(dá)到最大，因此選取45min作為硫酸二乙酯誘變的處理時(shí)間。

菌株UV-27經(jīng)過(guò)硫酸二乙酯處理45min的初篩、復(fù)篩后結(jié)果見(jiàn)表3。其中產(chǎn)酶活力最高的突變株為菌株DES-10，酶活力達(dá)到2.19U/g，是菌株UV-27的1.39倍。且多次傳代后能穩(wěn)定產(chǎn)酶。繼續(xù)對(duì)菌株DES-10進(jìn)行紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理。

表3 硫酸二乙酯誘變處理篩選到的高產(chǎn)菌株Table 3 Mutant strains with high tannase activity induced by DES

2.2.3 UV-硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理DNM1-39，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行物理、化學(xué)誘變，選育到一株產(chǎn)酶活力有明顯提高的菌株UD-6，其酶活力達(dá)到了2.80U/g，是出發(fā)菌株DNM1-39的1.77倍。菌種選育是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)最關(guān)鍵的一步。紫外線照射誘變和硫酸二乙酯誘變均使單寧酶的產(chǎn)量得到了提高，并且得到遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。

表4 UV-硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理篩選到的高產(chǎn)菌株Table 4 Mutant strains with high tannase activity induced by both ultraviolet irradiation and DES

由表4可知，菌株DES-10經(jīng)紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理后經(jīng)過(guò)多次初篩、復(fù)篩，最終得到1株單寧酶產(chǎn)量較高的菌株UD-6，連續(xù)傳代6次，其單寧酶活力仍能達(dá)到2.55U/g。

按照1.4.1.3節(jié)的方法，考察突變株UD-6的產(chǎn)單寧酶固體發(fā)酵進(jìn)程，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌株UD-6發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig. 3 Fermentation course curve of strain UD-6

由圖3可見(jiàn)，突變株UD-6培養(yǎng)前期主要進(jìn)行菌體的生長(zhǎng)，酶活力增加比較緩慢。培養(yǎng)30h后酶活力迅速增加，50h后候趨于平穩(wěn)，60h時(shí)單寧酶活力達(dá)最高值2.80U/g。由此分析，如果進(jìn)行發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化，菌株UD-6所產(chǎn)單寧酶活力仍有進(jìn)一步提升的空間。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從自然環(huán)境中分離篩選到一株單寧酶產(chǎn)生菌

[1] 李秧針, 邱樹毅, 保玉心, 等. 單寧酶發(fā)酵生產(chǎn)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)釀造, 2008(11): 1-6.

[2] 劉如石, 邱義蘭, 謝達(dá)平, 等.Asp.nigerNo.3單寧酶純化及性質(zhì)的研究[J]. 食品與機(jī)械, 2000(4): 15-16.

[3] 郭魯宏, 楊順楷. 單寧酶產(chǎn)生菌的篩選和發(fā)酵條件研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 1998, 4(4): 386-389.

[4] 劉如石, 李清明, 謝達(dá)平, 等.Asp.nigerNo.3液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶條件的研究[J]. 食品科學(xué), 2001, 22(2): 28-32.

[5] SHARMA S, AGARWAL L, SAXENA R K. Statistical optimization for tannase production fromAspergillus nigerunder submerged fermentation[J]. Indian J Microbiol, 2007, 47: 132-138.

[6] 劉小蘭, 楊順楷, 王忠彥. 青霉單寧酶高活性菌株的誘變選育[J]. 微生物學(xué)雜志, 2006, 26(3): 108-110.

[7] HADI T A, BANERJEE R, BHATTACHARYYA B C. Optimization of tannase biosynthesis by a newly isolatedRhizopus oryzae[J]. Bioprocess Engineering, 1994(11): 239-243.

[8] MONDAL K C, BANERJEE R, PATI B R. Tannase production byBacillus licheniformis[J]. Biotechnology Letters, 2000, 22(9): 767-769.

[9] AYED L, HAMDI M. Culture conditions of tannase production byLactobacillus plantarum[J]. Biotechnology Letters, 2002, 24: 1763-1765.

[10] KUMAR R, KUMAR A, NAGPAL R, et al. A novel and sensitive plate assay for screening of tannase-producing bacteria[J]. Ann Microbiol,2010, 60: 177-179.

[11] 郭魯宏, 楊亞力, 金丹, 等. 黑曲霉單寧酶產(chǎn)生菌的篩選及處理滇橄欖汁的研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18(增刊1): 16-18.

[12] 保玉心, 邱樹毅, 李秧針, 等. 一種胞外單寧酶的活力檢測(cè)方法[J].精細(xì)化工, 2008, 25(6): 621-624.

[13] 卞小瑩, 吳文君, 王群利, 等. 秦嶺鏈霉菌的原生質(zhì)體再生與誘變育種[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(6): 929-933.

[14] 孫金鳳, 吳薇, 潘翔. 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的分離篩選及其誘變育種[J].工業(yè)微生物, 2008, 38(2): 56-59.

[15] 周定, 王建龍. 檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉誘變選育的研究[J]. 微生物學(xué)雜志, 1993, 13(2): 4-7.

Breeding and Screening of a High-Yield Tannase-Producing Strain

TAO Su-fen1，ZHAO Xiang-ying2，LIU Jian-jun1,2,*
(1. School of Food and Biological Engineering, Shandong Polytechnic University, Jinan 250353, China；
2. Research and Design Institute of Food and Fermentation Industries of Shandong Province, Jinan 250013, China)

Tannase plays an important role in the food and fine chemical industries. The breeding and screening of a strain with high tannase activity are desired. A tannase-producing strain, DNM1-39, was isolated from resources rich in tannin. The activity of tannase in solid state medium after fermentation by the strain was 1.58 U/g. The strain was identified asAspergillusthrough morphologic observation. A mutant strain named as UD-6 was obtained from DNM1-39 mutagenization with ultraviolet irradiation alone, DES treatment alone and both of them. The tannase activity produced by UD-6 was 2.80 U/g. The tannaseproducing ability of UD-6 remained the same after continuous passages and displayed excellent genetic stability.

tannase；tannin；gallic acid；screening；mutagenesis

Q815

A

1002-6630(2012)01-0226-04

2011-01-26

陶素芬(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開發(fā)。E-mail：taosufen3729@126.com

*通信作者：劉建軍(1962—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開發(fā)。E-mail：liujj-2000@163.com