李翠霞，李 華，金 剛，杜立業(yè)，王 華,*

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

新疆葡萄酒產(chǎn)區(qū)優(yōu)良酒類酒球菌的分離、鑒定

李翠霞1,2,3，李 華2,3，金 剛2,3，杜立業(yè)2,3，王 華2,3,*

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

為了分離篩選出適合葡萄酒釀造的優(yōu)良酒類酒球菌(Oenococcus oeni)菌株，從我國新疆葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離純化出30株酒類酒球菌，依據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性，它們均被鑒定為酒類酒球菌。分別對其進行單因子(pH值、酒精、SO2)耐受性實驗，選出單因子抗性較好的9株菌進行復合因子(pH值×酒精×SO2)耐受性實驗，結(jié)果表明，有3株酒類酒球菌具有較好的發(fā)酵適應性。最后通過Species-specific PCR以及16S rRNA序列同源性分析對其進行驗證，并構(gòu)建相應的系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育分析表明所篩菌株與酒類酒球菌的同源性均達到了99%以上，說明本實驗所篩選的9株性能較好的菌株均為酒類酒球菌。

酒類酒球菌；分離；鑒定；種屬特異性；16S rRNA

酒類酒球菌(Oenococcus oeni)是葡萄酒進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation，MLF)過程中的優(yōu)勢菌種，隨著生物降酸技術(shù)的不斷發(fā)展及應用，優(yōu)良酒類酒球菌的篩選及鑒定越來越受到人們的關(guān)注，但是由于葡萄酒復雜的生態(tài)環(huán)境使得自然的MLF難以控制和預測，開發(fā)使用優(yōu)良的酒類酒球菌發(fā)酵劑，不但可以實現(xiàn)葡萄酒的規(guī)模化生產(chǎn)，而且可以有效地控制葡萄酒的質(zhì)量。我國獨特、復雜的生態(tài)地理環(huán)境也決定了我國葡萄酒產(chǎn)區(qū)必定存在著優(yōu)良的酒類酒球菌自然變異菌株，對其進行開發(fā)和利用對于改變我國葡萄酒的生產(chǎn)工藝具有非常重要的意義。

本研究采用梯度稀釋涂平板的方法從酒精發(fā)酵結(jié)束的單品種葡萄酒中分離酒類酒球菌，通過生理生化實驗、Species-specific PCR以及16S rRNA序列同源性分析相結(jié)合的方法對篩選的優(yōu)良酒類酒球菌進行鑒定，并分別對其進行單因子(pH值、酒精、SO2)和復合因子(pH值×酒精×SO2)耐受性實驗，以篩選出優(yōu)良的酒類酒球菌，為我國優(yōu)質(zhì)葡萄酒的生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品、菌株與試劑

樣品為新疆產(chǎn)區(qū)2010年酒精發(fā)酵結(jié)束后的單品種葡萄酒，葡萄品種分別為：赤霞珠、梅爾諾、佳美。

酒類酒球菌SD-2a由山東煙臺地區(qū)自然蘋果酸-乳酸發(fā)酵(M L F)的葡萄酒中分離鑒定得到，專利號為02123444.2，由西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院提供；嗜酸乳桿菌(編號6005)由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

放線菌酮(Actidione) 上海漢博生物科技有限公司；萬古霉素(Vancocin) 美國Eli Lilly公司；溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB) 美國Amresco公司；蛋白酶K 德國Merck公司；RNA酶(Rnase) 天根生化科技(北京)有限公司；Tris-飽和酚、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、TaqDNA 聚合酶 日本TaKaRa公司。

1.2 培養(yǎng)基

ATB基礎培養(yǎng)基[1]：蛋白胨1%、酵母浸出物0.5%、葡萄糖1%、MgSO4·7H2O 0.02%、MnSO4·4H2O 0.005%、鹽酸半胱氨酸0.5g/L、番茄汁25%、液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值至4.8，固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值至5.0，并向其中加2.0%的瓊脂，115℃滅菌20min。ATB分離培養(yǎng)基[1]：ATB基礎培養(yǎng)基中分別加入放線菌酮50mg/L、萬古霉素50mg/L。改良的MRS培養(yǎng)基[2]：蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、牛肉膏1%、葡萄糖2%、無水醋酸鈉0.3%、檸檬酸二銨0.2%、吐溫-80 0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、MgSO4·7H2O 0.02%、MnSO4·4H2O 0.005%、鹽酸半胱氨酸0.05%、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH6.8，固體培養(yǎng)基中加2.0%的瓊脂粉，121℃滅菌20min。

1.3 儀器與設備

Centrifuge 5804高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；PHS-3B型精密pH計 上海雷磁場儀器廠；752分光光度計 上海第三分析儀器廠；Veriti梯度基因擴增儀 美國ABI公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 英國Sysgene公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株的培養(yǎng)

1.4.1.1 酒類酒球菌分離純化

采用梯度稀釋涂平板的分離方法[3]，將酒精發(fā)酵結(jié)束的葡萄酒梯度稀釋為：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8后，吸取0.1mL涂于ATB分離培養(yǎng)基上對菌株進行分離，27℃厭氧箱中充氮氣培養(yǎng)5～7d，挑取ATB分離培養(yǎng)基上菌落形態(tài)[4]為乳白色、光滑、菌落直徑小于1mm的單菌落反復進行劃線分離直至純化。

1.4.1.2 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)

參照文獻[5]進行，將5%嗜酸乳桿菌接入改良的液體MRS培養(yǎng)基，靜置37℃培養(yǎng)48h，然后置于37℃固體劃線密封培養(yǎng)30h，挑取單菌落進行液體擴大培養(yǎng)48h。

1.4.2 菌株抗性篩選

1.4.2.1 單因子抗性實驗[6]

(1) 酒類酒球菌對pH值的抗性

將ATB基礎培養(yǎng)基沸水浴30min，10000r/min 離心15min至澄清，用KOH或HCl調(diào)節(jié)pH值分別為3.4、3.2、3.0，115℃滅菌20min后，以5×107CFU/mL的接種量分別接入處于對數(shù)生長期(pH4.8，ATB基礎培養(yǎng)基)的供試菌株，27℃靜置培養(yǎng)，用比濁法對菌密度(OD600nm)進行測定，10d后菌密度仍小于5×107CFU/mL為不生長。

(2) 酒類酒球菌對SO2的抗性

將ATB基礎培養(yǎng)基沸水浴30min，10000r/min 離心15min至澄清，115℃滅菌20min后，分別調(diào)節(jié)總SO2質(zhì)量濃度為20、30、50mg/L，以5×107CFU/mL的接種量分別接入處于對數(shù)生長期(pH4.8，ATB基礎培養(yǎng)基)的供試菌株，27℃靜置培養(yǎng)，用比濁法對菌密度(OD600nm)進行測定，10d后菌密度仍小于5×107CFU/mL為不生長。(3) 酒類酒球菌對酒精的抗性

將ATB基礎培養(yǎng)基沸水浴30min，10000r/min 離心15min至澄清，115℃滅菌20min后，分別調(diào)節(jié)酒精體積分數(shù)為10%、12%、14%，以5×107CFU/mL的接種量分別接入處于對數(shù)生長期(pH4.8，ATB基礎培養(yǎng)基)的供試菌株，27℃靜置培養(yǎng)，用比濁法對菌密度(OD600nm)進行測定，10d后菌密度仍小于5×107CFU/mL為不生長。

1.4.2.2 復合因子篩選實驗

參照Britz等[7]的方法，將能在所有單因子抗性條件下生長的菌株設定為單因子抗性較好的菌株，用單因子抗性較好的菌株進行復合因子(酒精×pH值×SO2)篩選實驗，采用不完全正交試驗設計，3個因素，共15個處理，如表1所示。

表1 菌株3因子(pH值×酒精×SO2)篩選實驗設計Table 1 Experimental design for strain screening

1.4.3 菌株鑒定

1.4.3.1 形態(tài)學鑒定

對菌株純化后ATB分離培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)為乳白色、光滑、單菌菌落直徑小于1mm的初篩菌株進行革蘭氏染色實驗[2]、過氧化氫酶實驗[8]，然后再參照文獻[9]對其進行鏡檢。

1.4.3.2 蘋果酸分解實驗

將初篩菌株按107CFU/mL的接種量接入含有3g/L的L-蘋果酸、pH4.8的ATB培養(yǎng)基中，每隔12h進行一次紙層析監(jiān)測，并觀察蘋果酸斑點的變化，蘋果酸斑點消失即為蘋果酸分解完畢[10]。

1.4.3.3 生理生化特性鑒定

根據(jù)張春暉等[4]、Holt等[11]、Dicks等[12]對酒類酒球菌生理生化特征的描述標準，并結(jié)合其釀酒適應性對初篩菌株進行鑒定。

1.4.3.4 分子生物學鑒定

(1) 菌株總DNA的提取

取5mL處于對數(shù)生長期的菌液進行離心收集，加入1mL TE緩沖液洗滌兩遍，離心后加入0.55mL TE緩沖液重懸并加入20μL 50mg/mL溶菌酶，振蕩混勻后37℃溫浴1h，然后加入30μL 10% SDS和10μL 20mg/mL蛋白酶K于37℃溫浴3h，接著加入100μL 5mol/L NaCl和80μ L CTAB-NaCl于65℃溫浴30min，5 μ L 10mg/mL RNA酶37℃溫浴3h，然后用等體積的酚、氯仿、異戊醇(25:24:1，V/V)抽提2～3次至無蛋白膜出現(xiàn)，再用氯仿、異戊醇(24:1，V/V)抽提1～2次至無蛋白膜出現(xiàn)，收集上清液并用50μL、3mol/L NaAc和500μL冷的異丙醇使其沉淀，12000r/min 離心10min后棄去上清液，沉淀用75%乙醇洗滌兩次，加入 60μL TE緩沖液溶解，最后在100V電壓條件下用1%瓊脂糖電泳約40min檢測所提取的DNA，并作為PCR擴增模板。

(2) 種屬特異性PCR(species-specific PCR)

參照文獻[13]，引物序列為On1：TAATGTGGTT CTTGAGGAGAAAAT；On2：ATCATCGTCAAAC AAGAGGCCTT，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

PCR反應體系(20μL)：以基因組DNA為模板，2.0μL 10×PCR buffer，1.6μL 2.5mmol/L dNTPs，1.6μL 25mmol/L Mg2+，10μmol/L上下游引物各0.8μL，0.5UTaq酶，2.0μ L模板DNA，用滅菌ddH2O補至2μL。

PCR擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性45s，64℃退火2min，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃末端延伸10min。然后將5 μL PCR產(chǎn)物與1.5 μL 6×Loading buffer混合后在100V電壓條件下用1%瓊脂糖電泳40min進行檢測。

(3) 16S rRNA的PCR擴增

參照文獻[14-16]，用上述制備的DNA為模板進行16S rRNA序列擴增，引物序列為On1(41～60bp)：5′-GCGGCGTGCCTAATACATGC- 3′和 On2(686～705bp)：5′-ATCTACGCATTTCACCGCTA- 3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

PCR反應體系(50μL)：5μL 10×PCR緩沖液，Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，上下游引物各0.5μmol/L，1.5UTaq酶，2μL DNA模板，用滅菌ddH2O補至50μL。

PCR擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃末端延伸10min。然后將3μL PCR產(chǎn)物與1μL 6×Loading buffer混合后在100V電壓條件下用1%瓊脂糖電泳40min進行檢測，PCR擴增片段約為705bp，對合格的樣品送往華大基因科技股份有限公司進行純化、回收和測序。將所測菌株的16S rRNA 序列與GenBank中已知的乳酸菌序列進行Blast相似性分析，鑒定菌種的歸屬，并用ClustalX 1.83序列分析軟件和MEGA 3.1遺傳分析軟件對其進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒類酒球菌的分離純化結(jié)果

圖1 初篩菌株菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of preliminarily screened O. oeni

圖2 初篩酒類酒球菌革蘭氏染色(a)、電鏡圖(b)Fig. 2 Gram stain and electron microscope photographs of O. oeni

篩選出30株菌，菌落形態(tài)均為乳白色、光滑、菌落直徑小于1mm(圖1)，革蘭氏染色均為陽性(圖2a)；過氧化酶陰性；并均能將L-蘋果酸分解成乳酸，同時按照文獻[9]鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌株的細胞均呈橢圓或球形，成對或是成鏈排列，不運動，不形成芽孢(圖2b)；符合《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[8]中對酒類酒球菌屬細菌形態(tài)學的描述標準，可初步推斷為酒球菌屬細菌。

2.2 釀酒適應性實驗

pH值、酒精、SO2是構(gòu)成葡萄酒理化性質(zhì)的重要組成成分，直接影響著酒類酒球菌在葡萄酒中的生存和生長，不同菌株對pH值、酒精、SO2的抗性不同，因此，綜合考慮酒類酒球菌對這3個因子的耐受性對于篩選優(yōu)良的酒類酒球菌非常必要。

2.2.1 單因子抗性篩選

通過研究篩選出的30株菌對pH值、酒精、SO2的單因子抗性，選出9株單因子抗性較好的菌株，分別編號為：XJ-1a、XJ-1b、XJ-2a、XJ-2b、XJ-2c、XJ-3a、XJ-3b、XJ-4a、XJ-5a。

2.2.1.1 菌株對pH值的抗性

圖3 不同pH值對酒類酒球菌生長的影響包Fig.3 Effect of pH on the growth of O. oeni

葡萄酒中的pH值是影響酒類酒球菌生長的重要因素，直接決定著MLF的正常啟動，由圖3可以看出，隨著pH值的不斷降低，對菌株的抑制作用不斷增強，當pH值為3.4時，XJ-1a的OD值最大，pH值為3.2、3.0時，對照菌株SD-2a和菌株XJ-1a、XJ-1b、XJ-2c、XJ-2a、XJ-3a均表現(xiàn)出了良好的抗性。

2.2.1.2 菌株對SO2的抗性

圖4 不同質(zhì)量濃度SO2對酒類酒球菌生長的影響Fig.4 Effect of SO2 on the growth of O. oeni

SO2作為葡萄酒釀造過程中廣泛使用的抗氧化劑，對細菌的生長具有明顯的抑制作用，由圖4可以看出，隨著SO2添加量的不斷增加，對菌株生長的抑制作用不斷增強，而且不同菌株對SO2的抗性也不同，在這9株單因子抗性較好的菌株中，除了XJ-3b對SO2抗性能力比較弱以外，其他菌株在SO2質(zhì)量濃度為50mg/L時，OD值均在0.4以上。

2.2.1.3 菌株對酒精的抗性

酒精也是酒類酒球菌在葡萄酒中生長的重要抑制因子，隨著酒精含量的不斷增加，菌株的生長量也在明顯減少，不同菌株對酒精的抗性也有很大的差異，如圖5所示，在這9株單因子抗性較好的菌株中，與對照菌株SD-2a相比，XJ-2a具有較強的耐酒精生長能力，而且其他菌株對14%的酒精也具有明顯的抗性。

圖5 不同體積分數(shù)酒精對酒類酒球菌生長的影響Fig.5 Effect of ethanol on the growth of O. oeni

2.2.2 3因子抗性篩選結(jié)果

圖6 酒精×pH值×SO2對酒類酒球菌生長的影響Fig.6 Combinatorial effect of ethanol, pH and SO2 on the growth of O. oeni

葡萄酒是一個復雜的生長環(huán)境，因此，考察菌株對pH值、酒精、SO2復合因子的耐受性對研究菌株的釀酒適應性非常重要。圖6結(jié)果表明，隨著選擇壓的不斷增大，對單因子具有較強抗性的9株菌的生長量均明顯減小，但不同菌株生長量減小的幅度不同，其中XJ-1b、XJ-5a生長量減小幅度較大，XJ-2a、XJ-2b、XJ-3a生長量減少幅度較小。通過對菌株在不同抗性條件下的生長量進行方差分析(表2)表明，XJ-2a生活能力最強，XJ-2b、XJ-3a次之，均與對照菌株SD-2a無明顯差異，其他菌株生長較弱，因此，XJ-2a、XJ-2b、XJ-3a為釀酒適應性較強的酒類酒球菌。

表2 不同脅迫條件下菌株生長量方差分析Table 2 Variance analysis for bacterial biomass under different stress conditions

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 生理生化實驗鑒定結(jié)果

通過對分離菌株進行蘋果酸分解實驗、石蕊牛奶實驗，以及碳源產(chǎn)酸情況等鑒定指標的考察，結(jié)果表明，所篩菌株均符合文獻[14]中對酒類酒球菌的描述標準，因此初篩菌株可鑒定為酒類酒球菌。

2.3.2 分子生物學鑒定結(jié)果

2.3.2.1 種屬特異性PCR

對所篩選的單因子抗性較好的9株菌、陽性對照O.oeni-SD-2a、陰性對照嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)進行種Species-specific PCR實驗。結(jié)果表明，本實驗所篩選的9株菌以及陽性對照菌株SD-2a均能擴增出蘋果酸-乳酸酶基因1025bp的唯一條帶，且條帶清晰，而嗜酸乳桿菌則未擴增出來(圖7)，可推斷本實驗所篩選的9株菌均為酒類酒球菌。

圖7 我國新疆葡萄酒產(chǎn)區(qū)篩選的9株酒類酒球菌的Species-specific PCR鑒定Fig.7 Species-specific PCR of O. oeni strains isolated from Xinjiang wines

2.3.2.2 16S rRNA的PCR擴增結(jié)果

分別以各菌株的總DNA為模板進行16S rRNA 的PCR擴增，9株實驗菌株和對照菌株O.oeni-SD-2a均得到了約705bp的擴增產(chǎn)物(圖8)。

將PCR產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司進行測序，并將結(jié)果提交到NCBI／GenBank，用Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知乳酸菌的16S rRNA基因序列進行相似性比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這9株菌的測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中酒類酒球菌的同源性均達到了99%以上，說明本實驗所篩選的9株菌均為酒類酒球菌。將這9株菌和鏈球菌科7個屬各自模式菌株的16S rRNA核苷酸序列比對后，以核苷酸序列為分子標記，用MEGA3.1軟件包中的鄰接法構(gòu)建了16個菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖9)，從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，本實驗所篩的9株菌與模式菌株O.oeni-PSU-1(NC_008528)處于相同的位置，通過對實驗菌株與鏈球菌科中7個屬模式菌16S rRNA基因序列建立的相似性矩陣(圖10)可以看出：9株實驗菌株的基因序列與O.oeni-PSU-1、O.oeni-SD-2a的相似性均為100%，再次驗證了本實驗所篩選的9株菌為酒類酒球菌，且Leuconostoc mesenteroides與O.oeni親源關(guān)系相對較近，相似性達到了84%，其次是魏斯氏菌屬。通過16S rRNA序列分析驗證了所分離的9株菌為酒類酒球菌。

圖8 酒類酒球菌16S rRNA基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.8 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA PCR products

圖 9 酒類酒球菌與鏈球菌科7個屬的模式菌的16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.9 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of O. oeni and model strains of 7 genera from Streptococcaceae

圖10 酒類酒球菌與鏈球菌科中7個屬的模式菌的16S rRNA基因序列的相似性矩陣Fig.10 Similarity matrix of 16S rRNA gene sequences of 7 genera from Streptococcaceae and O. oeni

3 討 論

由于傳統(tǒng)的生理生化鑒定不能滿足菌種精確鑒定的需要，16S rRNA序列同源性分析不僅費時而且測序成本較高，在初篩菌株歸屬不明確且量較大的情況下采用16S rRNA序列同源性分析對菌種進行鑒定十分浪費，且種屬特異性 PCR也可能出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象，因此可以先用屬特異性 PCR對初篩菌株進行鑒定，然后再通過16S rRNA序列同源性分析對其進行驗證，便可更加可靠的實現(xiàn)菌種的鑒定。

本實驗從新疆產(chǎn)區(qū)自然MLF發(fā)酵的葡萄酒中，通過對菌株個體和菌落形態(tài)的觀察，結(jié)合生理生化實驗、初步分離純化出30株酒類酒球菌。通過對其生長特性以及單因子釀酒適應性的研究表明，有9株酒類酒球菌具有較好的釀酒適應性，并用種屬特異性PCR及16S rRNA的序列同源性分析對其進行了進一步的驗證。然后用單因子抗性較好的9株酒類酒球菌進行復合因子耐受性實驗，結(jié)果表明：XJ-2a、XJ-2b和XJ-3a具有良好的釀酒適應性，可以將其作為葡萄酒MLF的優(yōu)良發(fā)酵菌種來使用。這也說明通過對自然MLF葡萄酒中酒類酒球菌的篩選可獲得具有良好釀酒適應性的菌株。在本研究的基礎上，本課題組還將對具有優(yōu)良釀酒適應性的菌株進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵活力和釀酒特性進行測定，篩選出具有良好的釀酒適應性以及優(yōu)良的發(fā)酵特性的菌株供商業(yè)生產(chǎn)使用。

[1]張春暉. 中國優(yōu)良酒類酒球菌的分離篩選及MLF研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學, 2001.

[2]錢存柔, 黃儀秀. 微生物學實驗教程[M]. 北京: 北京大學出版社, 1999.

[3]FUGELSANG K C. Wine microbiology[M]. New York: Chapman&Hall, 1997.

[4]張春暉, 李華. 葡萄酒微生物學[M]. 西安: 陜西人民出版社, 2003: 136-137.

[5]張帆, 王建華, 劉立恒, 等. 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)條件及其生物學特性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(3): 43-46.

[6]VAILLANT H, FORMISYN P, GERBAUX V. Malolactic fermentation of wine: study of the influence of some physico-chemical factors by experimental design assays[J]. Appl Bacteriol, 1995, 79: 640-650.

[7]BRITZ T J, TRACEY R P. The combination effect of pH, SO2, ethanol and temperature on the growth ofLeuconostoc oenos[J]. Appl Bacteriol, 1990, 68: 23-31.

[8]凌代文. 乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999: 57-58.

[9]程麗娟, 薛泉宏. 微生物學實驗技術(shù)[M]. 西安: 世界圖書出版西安公司, 2000: 21.

[10]HENICK-KLING T, SANDINE W E, HEATHERBELL D A. Evaluation of malolactic bacteria isolated from oregon wine[J]. Appl Environ Microbiol, 1989, 8: 2010-2016.

[11]HOLT J G, KRIEG N R, SNATH P H A, et al. Bergey,s manual of determinative bacteriology[M]. 9th ed. Batimore: Williams and Wilkins, 1993.

[12]DICKS L M T, DELLAGLIO F, COLLINS M D. Proposal to rechssifyLeuconostoc oenosasOenococcus oeni[J]. Bacteriol, 1995, 45(2): 395-397.

[13]ZAPPAROLI G, TORRIANI S, PESENTE P, et al. Design and evaluation of malolactic enzyme gene targeted primers for rapid identification and detection ofOenococcus oeniin wine [J]. Appl Microbiol, 1998, 27: 243-246.

[14]KUWAHARA T, NORIMATSU I, NAKAYAMA H, et al. Genetic variation in 16S－23S rDNA internal transcribed spacer regions and the possible use of this genetic variation for molecular diagnosis ofBacteroidesspecies[J]. Microbiology and Immunology, 2001, 45(3): 191-199.

[15]楊士章, 張煥新, 施帥, 等. 板鴨中優(yōu)勢乳酸菌的分離、篩選及鑒定[J]. 食品科學, 2010, 31(7): 242-246.

[16]金剛. 中國葡萄酒主產(chǎn)區(qū)酒酒球菌的鑒定及SE-AFLP分析[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學, 2010.

Isolation and Identification of ExcellentOenococcus oenifrom Xinjiang Wines

LI Cui-xia1,2,3，LI Hua2,3，JIN Gang2,3，DU Li-ye2,3，WANG Hua2,3,*
(1. College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China； 2. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；3. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

In order to screenOenococcusoeniwith good performance for malolactic fermentation (MLF), 3 strains ofO. oeniwere isolated and purified from Xinjiang wines, and identified preliminarily asO. oenibased on morphological, physiological and biochemical analyses. Their resistance to individual stress conditions such as pH, ethanol or SO2 was determined. In addition, the growth of 9 screened strains under the combinatorial external stress of ethanol, pH and SO2 was also evaluated. The results indicated that 3 strains had better adaptation capability to adverse conditions. The species-specific PCR and homology analysis of 16S rRNA sequence also supported our results. Moreover, a phylogenetic tree was established based on the 16S rRNA sequence ofO. oeni. The results of 16S rRNA sequencing showed that this strain was 99% homologous toO. oeni, so indicated that 9 screened strains with better performace wasO. oenispecies.

Oenococcus oeni；isolation；identification；species-specific PCR；16S rRNA

Q93.331

A

1002-6630(2012)01-0141-06

2011-01-23

農(nóng)業(yè)部“948”項目(2009-Z29)

李翠霞(1985—)，女，碩士，主要從事葡萄酒微生物學研究。E-mail：licuixiapujiu@163.com

*通信作者：王華(1959—)，女，教授，博士，主要從事葡萄與葡萄酒學研究。E-mail：wanghua@nwsuaf.edu.cn