那治國(guó)，馬永強(qiáng)*，韓春然，石彥國(guó)

(1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150086；

2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

高去酰胺蛋白酶產(chǎn)生菌的誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

那治國(guó)1，馬永強(qiáng)2,*，韓春然2，石彥國(guó)2

(1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150086；

2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

以地衣芽孢桿菌2709為出發(fā)菌株，采用氮離子注入技術(shù)，在最佳注入劑量為1.5×1015ions/cm2的條件下進(jìn)行誘變處理，篩選得到一株去酰胺度高達(dá)48.99%的突變株SDL-9，去酰胺度提高了85.57%，而肽鍵水解度相對(duì)較弱。并對(duì)SDL-9的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：最佳碳源為質(zhì)量濃度為2.0g/100mL的玉米粉，最佳氮源為質(zhì)量濃度3.0g/100mL的大豆蛋白，質(zhì)量濃度為0.04g/100mL Fe3+對(duì)產(chǎn)酶具有明顯的促進(jìn)作用，質(zhì)量濃度為0.9g/100mL谷氨酰胺對(duì)產(chǎn)酶有明顯的誘導(dǎo)作用，最佳起始pH值為7.0，最佳發(fā)酵溫度35℃，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)得去酰胺度為57.1%，肽鍵水解度為13.2%。

氮離子注入；去酰胺；堿性蛋白酶

離子注入技術(shù)是20世紀(jì)80年代興起的一種材料表面處理技術(shù)。1986年中國(guó)科學(xué)院等離子體物理所余增亮發(fā)現(xiàn)N+離子注入水稻種子的誘變作用，證實(shí)了質(zhì)量(粒子)沉積生物效應(yīng)的存在，開辟了低能離子與物質(zhì)相互作用這一新的研究方向[1-2]，是育種方法學(xué)的重要?jiǎng)?chuàng)新并從國(guó)內(nèi)走向世界。它與傳統(tǒng)的誘變?cè)慈鏧射線、γ射線、UV射線以及化學(xué)誘變劑相比，離子注入除有能量沉積外，還有動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積及電荷交換等效應(yīng)[3-4]，所以離子束注入技術(shù)是一種集理化誘變因子于一體的綜合技術(shù)方法，具有高效、高定向性、損傷輕、突變譜廣的特點(diǎn)[5-6]。經(jīng)過(guò)多年努力，該技術(shù)在植物、動(dòng)物和微生物品種改良上取得了良好效果[7-9]，為生物的遺傳改良開辟了一條新的途徑，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

去酰胺是近年來(lái)在蛋白改性研究中備受關(guān)注的研究課題之一，由于蛋白肽鏈上的酰胺基對(duì)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)形成的貢獻(xiàn)率較高，所以對(duì)蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性性等具有重要影響。由此，研究者希望能通過(guò)部分脫除蛋白肽鏈上的酰胺基，達(dá)到改善蛋白質(zhì)某些功能特性的目的。常用的去酰胺改性方法包括物理方法、化學(xué)方法和生物酶法。由于物理方法和化學(xué)方法在去酰胺改性上存在一定的不足[10-13]，而隨著酶工業(yè)、固定化酶技術(shù)和膜反應(yīng)器的不斷發(fā)展，酶解過(guò)程更趨于自動(dòng)化、簡(jiǎn)單化，酶法去酰胺改性已成為一種趨勢(shì)。在酶法去酰胺改性中，常用的酶有木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以及微生物堿性蛋白酶等，由于動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶存在提取生產(chǎn)復(fù)雜，價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，而微生物堿性蛋白酶雖然具有原料來(lái)源低廉、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，但現(xiàn)有的堿性蛋白酶去酰胺能力普遍不高，所以去酰胺改性的應(yīng)用受到了限制[14-15]。因此，隨著我國(guó)大豆蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，應(yīng)用誘變技術(shù)篩選高去酰胺活性堿性蛋白酶產(chǎn)生菌顯得尤為重要。本研究采用氮離子注入技術(shù)對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行誘變處理，篩選高去酰胺活性堿性蛋白酶產(chǎn)生菌，并優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，以期為高去酰胺活性堿性蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

地衣芽孢桿菌2709(Bacillus licheniformis2709) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(編號(hào)10266)。

平板培養(yǎng)基：牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、NaCl 0.5g、瓊脂1.5g、蒸餾水100mL，pH7.2。種子培養(yǎng)基：牛肉膏1.0g、蛋白胨1.0g、NaCl 0.5g、蒸餾水100mL，pH7.0～7.2?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.0g、麩皮1.0g、黃豆餅粉2.0g、酵母膏2.0g、Na2HPO40.2g、KH2PO40.1g、CaCO31.0g、蒸餾水100mL，pH7.0～7.2。

1.2 試劑與儀器

大豆分離蛋白(A型) 哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；茚三酮(分析純) 北京亞太龍興化工有限公司；甘氨酸 天津市大陸化學(xué)試劑廠；谷氨酰胺 中國(guó)惠世生化試劑有限公司。

多功能等離子體浸沒離子注入裝置 哈工大材料科學(xué)與工程學(xué)院研制；UDK152型全制動(dòng)凱氏定氮儀 意大利威爾普公司；KYC-100型恒溫?fù)u床 北京晨曦勇創(chuàng)科技有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CL-32L自動(dòng)高壓滅菌器 日本ALP公司；TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶

將供試菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后作為種子液，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于裝有30mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，于30℃、140r/min搖床發(fā)酵48h后，10000r/min離心10min，取上清液，即得粗酶液。

1.3.2 氮離子注入誘變處理

菌膜的制備：將活化后的地衣芽孢桿菌2709，在30℃、140r/min條件液體種子培養(yǎng)到對(duì)數(shù)增殖期中期后，制成細(xì)胞濃度約為108個(gè)/mL的菌懸液。取0.4mL菌懸液采用無(wú)菌操作，涂布于滅菌的小鋁盒(直徑2cm)內(nèi)，無(wú)菌室下自然風(fēng)干后立即進(jìn)行氮離子注入誘變處理。

氮離子注入誘變處理：將菌膜放入氮離子注入機(jī)中，在真空度為6.0×10-1Pa，注入能量為25keV，注入劑量為0.5×1015～2.5×1015ions/cm2的條件下進(jìn)行氮離子注入處理，同時(shí)做真空對(duì)照。誘變后用無(wú)菌脫脂棉，蘸無(wú)菌生理鹽水，仔細(xì)擦帶菌株的小鋁盒，將脫脂棉放入5mL含玻璃珠無(wú)菌生理鹽水中，振蕩器振蕩3min，得到誘變后的菌懸液。最后按平板菌落計(jì)數(shù)法，進(jìn)行梯度稀釋、涂布培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算不同注入劑量的致死率，繪制致死率曲線，從中選取最佳注入劑量。

1.3.3 篩選方法

將誘變后的菌懸液涂布在平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48～60h，挑選形態(tài)好的單菌落，分別接種于裝有30mL種子培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，30℃、140r/min條件下富集培養(yǎng)18h后，按1.3.1節(jié)方法發(fā)酵產(chǎn)酶，制得粗酶液，以去酰胺度和肽鍵水解度為指標(biāo)，挑選去酰胺能力強(qiáng)而肽鍵水解能力弱的菌株。

篩選標(biāo)準(zhǔn)：以出發(fā)菌株為對(duì)照，去酰胺度(DD)提高率≥0%，而肽鍵水解度(DH)相對(duì)較低的為正突變株；去酰胺度(DD)提高率≤10%為負(fù)突變株；去酰胺度(DD)提高率在0%～10%的為非突變株。

1.3.4 遺傳穩(wěn)定性考察

為了確保篩選到的高去酰胺菌株具有遺傳穩(wěn)定性，對(duì)氮離子注入誘變后得到的突變株SDL-9進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性考察。每代實(shí)驗(yàn)過(guò)程：突變菌株→平板分離→單菌落→斜面→種瓶→搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶，制得粗酶液，測(cè)定去酰胺度和肽鍵水解度，并與各自初代進(jìn)行比較。共傳5代，每代均做3個(gè)平行。

1.3.5 突變菌株SDL-9產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

將突變菌株SDL-9進(jìn)行種子培養(yǎng)后，按1.3.1節(jié)方法發(fā)酵產(chǎn)酶，制得粗酶液。以去酰胺度和肽鍵水解度為指標(biāo)，研究不同培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)酶的影響，并以玉米粉添加量(A)、大豆蛋白添加量(B)、Fe3+添加量(C)、谷氨酰胺添加量(D)為因素，分別選取3個(gè)水平，以去酰胺度為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)確定最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，同時(shí)，采用單因素試驗(yàn)研究起始pH值及發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響，確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

1.3.6 肽鍵水解度(DH)的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 去酰胺度(DD)的測(cè)定

采用微量彌散皿法，具體操作參照文獻(xiàn)[17]方法。

1.3.8 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用半微量凱氏定氮法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子生長(zhǎng)曲線

將活化后的出發(fā)菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在30℃、140r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)30h，每2h取樣測(cè)定發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)處的光密度值，繪制種子生長(zhǎng)曲線。由圖1可見，地衣芽孢桿菌2709的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為14～22h。

圖1 地衣芽孢桿菌2709生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus licheniformis 2709

2.2 氮離子注入誘變選育高去酰胺活性堿性蛋白酶產(chǎn)生菌

2.2.1 不同注入劑量對(duì)菌株的影響

圖2 氮離子注入劑量的致死率曲線Fig.2 Lethal rate curve of Bacillus licheniformis 2709 under different doses of nitrogen ion implantation

采用不同注入劑量0.5×1015～2.5×1015ions/cm2，進(jìn)行氮離子注入誘變，平板培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)，同時(shí)做真空對(duì)照，計(jì)算不同劑量下的致死率，結(jié)果見圖2。

如圖2所示，實(shí)驗(yàn)菌株在經(jīng)過(guò)離子注入后呈現(xiàn)致死率隨注入劑量先上升后下降，最后再上升的趨勢(shì)，這種現(xiàn)象是符合離子注入誘變“馬鞍型”劑量-效應(yīng)曲線的。由于最佳的注入劑量應(yīng)該在致死率曲線波谷區(qū)域，故地衣芽孢桿菌2709的最佳注入劑量為1.5×1015ions/cm2。

2.2.2 氮離子注入誘變的篩選結(jié)果

在真空度為6.0×10-1Pa，注入能量為25keV，注入劑量為1.5×1015ions/cm2的條件下進(jìn)行氮離子注入誘變。經(jīng)平板培養(yǎng)、發(fā)酵產(chǎn)酶，以去酰胺度和肽鍵水解度為指標(biāo)，對(duì)突變株進(jìn)行篩選，部分結(jié)果如表1所示。

表1 氮離子注入誘變篩選結(jié)果Table 1 Screening results of mutant strains resulting from nitrogen ion implantation

由表1可見，經(jīng)氮離子注入誘變后，有28株突變株的去酰胺度提高10%以上，但其中突變株SDL-17、SDL-49、SDL-101和SDL-104的肽鍵水解度相對(duì)較高，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，這4株菌不屬于正突變株，所以共有24株菌為正突變株。并且正突變中有4株(SDL-1、SDL-7、SDL-8、SDL-9)的去酰胺度提高了60%以上，其中突變株SDL-9的去酰胺度高達(dá)48.99%，比出發(fā)菌株的去酰胺度提高了85.57%。可見，氮離子注入的誘變方法在誘變地衣芽孢桿菌產(chǎn)高去酰胺活性堿性蛋白酶上是一種較高效率的誘變手段。

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性考察

為了確定突變株SDL-9是否具有產(chǎn)高去酰胺活性堿性蛋白酶的遺傳穩(wěn)定性，做了斜面培養(yǎng)基的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 遺傳穩(wěn)定性比較Table 2 Genetic stability of SDL-9

從表2可以看出，在實(shí)驗(yàn)傳5代范圍內(nèi)，突變株SDL-9具有良好的遺傳穩(wěn)定性，去酰胺度變化范圍在99%～104%之間，肽鍵水解度變化范圍在100%～126%之間。

2.3 突變菌株SDL-9產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別以質(zhì)量濃度為1.0g/100mL的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉和玉米粉作為碳源，發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖3。

圖3 不同碳源對(duì)產(chǎn)去酰胺蛋白酶的影響Fig.3 Effect of carbon source type on the production of protease

由圖3可知，以玉米粉作為碳源時(shí)產(chǎn)酶的去酰胺度最高，其次為可溶性淀粉，且前者的肽鍵水解度略低于后者。同時(shí)還可以看出，易利用碳源如葡萄糖、麥芽糖等作為碳源時(shí)對(duì)產(chǎn)酶有一定的抑制作用，產(chǎn)酶的去酰胺度和肽鍵水解度都較低，這可能是由于代謝產(chǎn)物的阻遏作用?？紤]到要選擇的是去酰胺能力強(qiáng)，而肽鍵水解能力弱的產(chǎn)酶條件，所以選擇玉米粉為發(fā)酵產(chǎn)酶碳源。

2.3.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖4 不同氮源對(duì)產(chǎn)去酰胺蛋白酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source type on the production of protease

分別以質(zhì)量濃度為2.0g/100mL的硫酸銨、牛肉膏、大豆蛋白、酪素、黃豆餅粉及蛋白胨為氮源，發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，不同氮源對(duì)堿性蛋白酶的去酰胺能力和肽鍵水解能力的貢獻(xiàn)不同。以牛肉膏作為氮源的去酰胺度最高為50.58%，其次是大豆蛋白為50.24%，而以大豆蛋白為氮源的肽鍵水解度要低于以牛肉膏為氮源的，而又考慮到大豆蛋白的生產(chǎn)規(guī)模大、價(jià)格低等因素，所以選擇大豆蛋白作為發(fā)酵產(chǎn)酶氮源。

2.3.3 不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.02g/100mL的不同金屬離子，發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖5。

圖5 金屬離子對(duì)產(chǎn)去酰胺蛋白酶的影響Fig.5 Effect of metal ions on the production of protease

由圖5可知，Ca2+、Fe3+對(duì)菌種產(chǎn)酶的去酰胺能力有明顯的促進(jìn)作用，其中Fe3+對(duì)菌種產(chǎn)酶的肽鍵水解能力有一定的抑制作用；而Cu2+對(duì)菌種產(chǎn)酶的去酰胺能力有明顯的抑制作用；另外，Mg2+、Mn2+、Zn2+對(duì)菌種產(chǎn)酶的去酰胺能力和肽鍵水解能力無(wú)明顯影響，故選擇金屬離子Fe3+考察其對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2.3.4 誘導(dǎo)物谷氨酰胺對(duì)產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度為0.9g/100mL的谷氨酰胺最為誘導(dǎo)物，發(fā)酵產(chǎn)酶，以未加誘導(dǎo)物為對(duì)照，測(cè)定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖6。

圖6 谷氨酰胺對(duì)產(chǎn)去酰胺蛋白酶的影響Fig.6 Effect of glutamine on the production of protease

由圖 6 可知，谷氨酰胺對(duì)菌株產(chǎn)酶的去酰胺能力有明顯促進(jìn)作用，并隨著添加量的增加而增大，到0.9g/100mL時(shí)去酰胺度達(dá)到最高為55.61%，以后變化不明顯；但谷氨酰胺誘導(dǎo)物對(duì)其肽鍵水解度的影響不顯著。

2.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal array design and results

從表3極差(R)的結(jié)果可以看出，各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶去酰胺度的影響程度為A＞D＞B＞C，即玉米粉添加量＞谷氨酰胺添加量＞大豆蛋白添加量＞Fe3+添加量，最優(yōu)水平組合為A2B3C2D3，此組合在上述9個(gè)試驗(yàn)組中未出現(xiàn)，故需在此條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得A2B3C2D3組合條件下酶液的去酰胺度為56.9%，比試驗(yàn)組4號(hào)的去酰胺度56.2%略高，故確定高去酰胺蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C2D3，即玉米粉(碳源)添加量為2g/100mL，大豆蛋白(氮源)添加量為3g/100mL，F(xiàn)e3+添加量為0.04g/100mL，谷氨酰胺(誘導(dǎo)物)添加量為0.9g/100mL。

2.3.6 起始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為4～10，發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定粗酶液的去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖7。

圖7 起始pH值對(duì)產(chǎn)去酰胺蛋白酶的影響Fig.7 Effect of initial fermentation pH on the production of protease

由圖7可知，培養(yǎng)基起始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的去酰胺度和肽鍵水解度影響較大，pH值為7時(shí)去酰胺度最高，pH值為6～8時(shí)肽鍵水解度較高，且相差不大。考慮到要選擇的是去酰胺能力強(qiáng)而肽鍵水解能力弱的發(fā)酵條件，所以培養(yǎng)基起始pH值為7.0時(shí)產(chǎn)酶效果最好，為最適pH值。

2.3.7 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

按照以上得到的結(jié)果，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別于25～55℃條件下發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定其去酰胺度和肽鍵水解度，結(jié)果見圖8。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)去酰胺蛋白酶的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on the production of protease

發(fā)酵溫度能夠顯著影響微生物的生長(zhǎng)速率和代謝途徑，過(guò)高或過(guò)低的培養(yǎng)溫度都會(huì)影響生物體內(nèi)的活性，從而影響產(chǎn)物的合成。由圖8可見，發(fā)酵溫度為35℃時(shí)去酰胺度最高，而肽鍵水解度相對(duì)較低，故為最適發(fā)酵溫度。

3 結(jié) 論

采用氮離子注入技術(shù)，以地衣芽孢桿菌2709為出發(fā)菌株，在試驗(yàn)確定的最佳注入劑量(1.5×1015ions/cm2)的條件下進(jìn)行誘變處理，篩選獲得了一株所產(chǎn)堿性蛋白酶的去酰胺能力有顯著提高的菌株SDL-9，去酰胺度高達(dá)48.99%，比誘變前提高了85.57%，而肽鍵水解度相對(duì)較弱，并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

以去酰胺度和肽鍵水解度為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)突變菌株SDL-9發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：最佳碳源為2.0g/100mL玉米粉，最佳氮源為3.0g/100mL大豆蛋白，0.04g/100mL的Fe3+對(duì)產(chǎn)酶具有明顯的促進(jìn)作用，在培養(yǎng)基中添加0.9g/100mL的谷氨酰胺對(duì)產(chǎn)高去酰胺堿性蛋白酶具有明顯的誘導(dǎo)作用，最佳起始pH7.0，最佳發(fā)酵溫度35℃，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)得去酰胺度為57.1%，肽鍵水解度為13.2%。

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Breeding of Strain Producing Protease with High Deamidation and the Optimization of Fermentation Conditions

NA Zhi-guo1，MA Yong-qiang2,*，HAN Chun-ran2，SHI Yan-guo2
(1. Department of Food and Environmental Engineering, East University of Heilongjiang, Harbin 150086, China；
2. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The original strainBacillus licheniformis2709 was mutagenized by means of nitrogen ion implantation at the optimal implantation dose of 1.5 × 1015ions/cm2. As a result, a mutant strain with a deamidation capacity of 48.99% (increased by 85.57% compared with the original strain) but a relatively weak ability to cleave peptide bonds named as SDL-9 was obtained. The orthogonal array design method was used for the optimization of fermentation conditions for production of alkaline protease with high deamidation capacity by SDL-9. The optimal fermentation conditions were 2 g/100 mL corn meal as the carbon source, 3 g/100 mL soybean protein as the nitrogen source, 0.04 g/100 mL Fe3+with distinct promoting effect on enzyme production, 0.9 g/100 mL glutamine that could notably induce enzyme production, initial pH 7.0, and temperature 35 ℃. Under these conditions, the deamidation capacity and hydrolysis degree of peptide bonds were 57.1% and 13.2%, respectively.

nitrogen ion implantation；deamidation；alkaline protease

Q939.97

A

1002-6630(2012)01-0174-06

2011-09-30

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z329)

那治國(guó)(1980—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：nazhiguo1980@126.com

*通信作者：馬永強(qiáng)(1963—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：mayq@hrbcu.edu.cn