楊琳沐 肖炳坤 楊建云 黃榮清

1.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

香蘭素衍生物是由香草醛經(jīng)過取代反應(yīng)及甲氧基化反應(yīng)合成的[1]。目前廣泛用于醫(yī)藥、香料、農(nóng)藥、有機(jī)合成及藥用輔料等領(lǐng)域。另經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，香蘭素衍生物能清除自由基，具有良好的抗氧化活性[2-3]，對(duì)細(xì)胞基因組織損傷和細(xì)胞凋亡均有良好的保護(hù)作用[4]，能夠促進(jìn)DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)，有效防護(hù)細(xì)胞凋亡和基因損傷[5]，作為一種食品添加劑和香料，其毒性較低，氣味芳香，服用順應(yīng)性好[6]，作為一種低劑量輻射損傷保護(hù)劑，極具開發(fā)前景。本文建立了一種高效液相色譜法測(cè)定其片劑中香蘭素衍生物的含量，此方法簡(jiǎn)便、快捷，具有較高的專屬性和靈敏度，為片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了有力的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Waters2695四元泵，2996二極管陣列檢測(cè)器，美國Waters公司），Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Waters公司）；BP211D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-3200超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），LDZ5-2醫(yī)用離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

1.2 試藥

香蘭素衍生物片（規(guī)格：50 mg， 批號(hào)：100304、101019、111028，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供），香蘭素衍生物對(duì)照品（批號(hào)：091206，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供），甲醇（色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑有限公司）；水（杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司）；冰醋酸（分析純，北京化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-0.002%醋酸（40︰60）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：306 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量 20 μL。

2.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 空白輔料按照處方量配制輔料，精密稱取輔料約15 mg，置25 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲30 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾。精密移取濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1（A）。取流動(dòng)相甲醇-0.002%醋酸（40︰60）20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1（B）。結(jié)果表明，片劑輔料無干擾。

2.2.2 香蘭素衍生物對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 精密稱取香蘭素衍生物對(duì)照品約20 mg，置50 mL量瓶中，加適量甲醇溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL含香蘭素衍生物約0.4 mg的溶液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液制備 精密移取“2.2.2”項(xiàng)下香蘭素衍生物對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1（C）。

2.2.4 樣品溶液制備 取香蘭素衍生物片10片（批號(hào)：101019），研細(xì)，精密稱取片粉約25 mg（相當(dāng)于香蘭素衍生物約10 mg），置25 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲振蕩30 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，精密移取上清液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1（D）。

圖1 流動(dòng)相、輔料、對(duì)照品、及樣品溶液高效液相色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下儲(chǔ)備液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取20 μL注入液相色譜儀。以溶液濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)作線性回歸，得回歸方程為 Y=1.15×108X+3.66×106（r=0.999 6，n=7）。 結(jié)果表明：香蘭素衍生物濃度在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密移取“2.2.2”項(xiàng)下儲(chǔ)備液5 mL置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，香蘭素衍生物峰面積RSD為0.07%，表明此方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取香蘭素衍生物片10片（批號(hào)：101019），研細(xì)，精密稱取片粉約25 mg（相當(dāng)于香蘭素衍生物約10 mg），共6份，按“2.2.4”項(xiàng)下操作，制得樣品溶液，分別取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計(jì)算香蘭素衍生物百分含量，平均含量為99.1%，RSD為0.70%（＜1%），表明方法重復(fù)性良好[7]。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液及“2.2.4”項(xiàng)下的樣品溶液，在室溫下放置 2、4、6、8、10 h，分別取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，峰面積RSD分別為0.28%和0.05%，結(jié)果表明溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

采用回收法，精密稱取片粉約25 mg，分別加入對(duì)照品適量，置50 mL量瓶中，按“2.2.4”項(xiàng)下操作，測(cè)定回收率。見表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=9）

2.8 樣品含量測(cè)定

精密稱取樣品片粉適量（約相當(dāng)于香蘭素衍生物10 mg），按“2.2.4”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果三批樣品含量分別為標(biāo)示量的99.3%，100.8%和99.6%，平均含量為99.9%，RSD為0.79%。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇

取對(duì)照品溶液在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在215、230、306 nm處有最大吸收。在215 nm處流動(dòng)相有較強(qiáng)的背景吸收，易干擾測(cè)定。230 nm處為一肩峰，吸光度值變化較大，也不適合作為檢測(cè)波長。故檢測(cè)波長定為306 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參考有關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，考察了乙腈-水系統(tǒng)，甲醇-水系統(tǒng)，甲醇-異丙醇-水系統(tǒng)，甲醇-水-乙二胺系統(tǒng)及甲醇-水-冰醋酸系統(tǒng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙腈-水系統(tǒng)出峰時(shí)間過早，但是甲醇-水系統(tǒng)峰形不夠理想。在甲醇-水系統(tǒng)中加入異丙醇，對(duì)峰形均無明顯改善，而在系統(tǒng)中加入乙二胺后，主成分出峰時(shí)間過早。最終通過改變冰醋酸的濃度，使峰形對(duì)稱度良好并且理論塔板數(shù)大于5 000。最終確定了流動(dòng)相組成為甲醇-0.002%醋酸（40︰60）。

3.3 溶劑的選擇及樣品處理

香蘭素衍生物在甲醇中溶解，在水中幾乎不溶，故先加入適量甲醇，并超聲30 min，使片粉中的主藥成分充分溶解，再加入甲醇稀釋至刻度，以減少樣品溶液中淀粉等多糖類輔料的溶解，延長色譜柱使用壽命。在進(jìn)樣前以孔徑為0.22 μm的濾頭過濾，防止樣品中不溶于甲醇的成分影響測(cè)定結(jié)果或堵塞液相色譜系統(tǒng)。

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[3]鄭紅，汪思應(yīng)，嚴(yán)雨倩，等.香蘭素衍生物對(duì)輻射損傷細(xì)胞保護(hù)作用的初步研究[J].輻射防護(hù)，2008，28（4）：226-231.

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