邵先舫，李 前，李 瑩，嚴(yán) 望

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院，湖南 常德 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬一醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是廣泛存在于動植物和微生物中的一類小分子疏水性跨膜蛋白，其生理功能是選擇性通透水。到目前為止，人們已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)并克隆了13種水通道蛋白（AQP0-12）。不同的AQP家族具有特異的組織分布并參與特定的生理功能[1]。AQP-3最先是在小鼠腎臟中提取[2]，隨后發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸、肝、胰腺、肺、前列腺、脾和皮膚中均有表達。AQP-3除了可通透水外，還可選擇性通透甘油和尿素，在機體體液平衡中發(fā)揮重要作用。本研究利用實時熒光定量PCR和Western blotting的方法，觀察AQP-3在SD大鼠正常骨骼肌中的表達，為深入研究AQP-3在骨骼肌正常及病理狀態(tài)下的表達和生理作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集8只6月齡SD大鼠左后肢外側(cè)股四頭肌肌群中約200 mg肌肉組織，無菌生理鹽水沖洗去除表面血液，分兩份，每份約100 mg，置入2 mL凍存管中，迅速保存于液氮中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中備用。

1.2 實時熒光定量PCR檢測

總RNA提?。簶颖居靡旱谘欣徶醒心コ煞蹱?，提取標(biāo)本總RNA，并溶于DEPC水，各標(biāo)本總RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測其質(zhì)量；以DEPC水作空白對照，用紫外分光光度儀測定RNA濃度及樣本A260與A280比值，檢測其純度。每個樣本分別取1 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA的合成：選用Random hexamer primer 1 μL，加無核酶水至12 uL；5×reaction buffer 4 μL， RiboLockTM RNase Inhibitor（20u/uL）1 μL，10 mM dNTP Mix 2 μL，RevertAid TM M-MuLV Reverse Transciptase（200 u/uL）1 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。經(jīng)25℃ 5 min、42℃60 min、70℃ 5 min后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１緦嶒炦x用GAPDH為內(nèi)參基因，其上游引物序列5'-GTG GAG TCT ACT GGC GTCTT-3'，下游引物序列5'-TTG CTG ACA ATC TTG AGGG-3'；AQP3上游引物序列5'-GTG CTG GCC ATT GTT GAC C-3'，下游引物序列5'-GGC CAG CTT CAC ATT CTC T-3'；采用ABI 7500 Real time PCR儀配制單基因單模板20 μL反應(yīng)體系；擴增條件：95℃，預(yù)變性7 min，95℃10 s，55℃（收集熒光）30 s，共40個循環(huán)；每個cDNA模板、每個基因重復(fù)3次，以內(nèi)參基因GAPDH為參照，目標(biāo)基因AQP-1擴增結(jié)果以2-△△CT表示，得出（±s）。

1.3 Western blot分析

1.3.1 細胞膜蛋白的提取 將50 mg肌肉組織放入研缽中，加入液氮不斷研磨成粉狀，然后將粉末置入1 mL的組織裂解液中，充分混勻后置于冰上裂解30 min，放入離心機中以4℃、10000 g離心5 min，取上清液使用BCA法測蛋白濃度。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 配制10%SDS-PAGE凝膠，濃縮膠5%，取50 μg蛋白質(zhì)樣品，加入等體積上樣緩沖液中，經(jīng)100℃沸水中煮5 min，上樣后在凝膠上加85 V電壓穩(wěn)壓電泳30 min，待染料前沿進入分離膠后將電壓提高到130 V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍到達分離膠的底部（約1.5 h）。硝酸纖維素膜（NC膜）100 V濕轉(zhuǎn)70 min；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，待用。

1.3.3 免疫印跡 將封閉的NC膜用TBS-T漂洗2次，加入用5%脫脂奶粉稀釋（濃度為1:500）的AQP 3多克隆抗體中，4℃下反應(yīng)過夜，TBS-T漂洗NC膜10 min×3次，加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫下孵育60 min，TBS-T漂洗NC膜10 min×3次，最后經(jīng)ECL發(fā)光液顯影。采用凝膠成像分析軟件分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR檢測

大鼠骨骼肌組織中AQP-3 mRNA表現(xiàn)出穩(wěn)定擴增狀態(tài)。各檢測樣品間AQP-3 mRNA的表達量，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。內(nèi)參基因GAPDH和AQP-3mRNA的溶解曲線如下，提示未出現(xiàn)非特異性擴增。結(jié)果見圖1-3。

圖1 AQP-3 mRNA在大鼠正常肌肉組織中的表達

圖2 GAPDH溶解曲線

圖3 AQP-3 mRNA溶解曲線

2.2 Western blotting檢測

骨骼肌組織中細胞膜蛋白AQP-3在36KD處顯示特異性條帶，且所有樣本的條帶灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示AQP-3在骨骼肌中穩(wěn)定表達。結(jié)果見圖4。

圖4 AQP-3在大鼠正常肌肉組織中的表達

3 討論

AQP-3是水通道蛋白家族中對水-甘油共同轉(zhuǎn)運的疏水性細胞膜蛋白，Wakayama Y等人通過研究在基因和蛋白水平證實了AQP-3在人骨骼肌中的存在，在形態(tài)學(xué)上AQP-3表達主要位于骨骼肌細胞膜的內(nèi)表面[3]。

本實驗結(jié)果表明，在大鼠骨骼肌組織中均有AQP-3基因和蛋白質(zhì)表達，提示AQP-3可能參與大鼠骨骼肌組織內(nèi)液體平衡，在促進大鼠骨骼肌水代謝、維持骨骼肌液體平衡方面可能有重要作用。AQP-3在骨骼肌鈍挫傷后骨骼肌組織中的表達情況及生理作用有待進一步研究。

[1]楊寶學(xué),趙雪儉.水通道蛋白研究進展[J].中國病理生理雜志,2005,21(8):1 619-1 622.

[2]Ishibashi K,Sasaki S,Fushimi K,et al.Molecular cloning and expression of a member of the aquaporin family with permeability to giycerol and urea in addition to water expressed at the basolateral membrane of kidney collecting duct cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,9(1):6 269-6 273.

[3]Wakayama Y,Jimi T,Inoue M,et al.Expression of Aquaporin 3 and its Localization in Normal Skeletal Myof i bres[J].The Histochemical Journal,2002,36(6):331-337.