孫繼民 ，魏寶陽(yáng) ，譚炎寧 ，張逸妍 ，羅尊長(zhǎng) ，黃鳳球

（1.湖南省土壤肥料研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；

4.國(guó)家雜交水稻工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

臘八豆是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一，它富含蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素，營(yíng)養(yǎng)豐富，易于消化吸收，滋味鮮美，倍受人們喜愛(ài)；并且研究發(fā)現(xiàn)它具有大豆異黃酮、大豆多肽等功能性成分，有利于人們的健康[1-2]。傳統(tǒng)方法制作臘八豆，是在自然環(huán)境條件下發(fā)酵釀制而成，可能產(chǎn)生黃曲霉毒素B1等有毒物質(zhì)，還存在季節(jié)性強(qiáng)、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室于1997年首次利用毛霉菌M2為菌源，人工接種，人工調(diào)控發(fā)酵，在春季進(jìn)行臘八豆產(chǎn)品的研制和生產(chǎn)試驗(yàn)。此法縮短了臘八豆的生產(chǎn)周期，擴(kuò)大了生產(chǎn)量，取得了工業(yè)化生產(chǎn)的成功，為傳統(tǒng)臘八豆的工業(yè)化、規(guī)模化、商品化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[3-5]，但在發(fā)酵過(guò)程及臘八豆產(chǎn)品品質(zhì)方面仍有些不盡如人意的地方。為適應(yīng)市場(chǎng)需求，降低臘八豆生產(chǎn)成本，節(jié)省能源，需要選育出發(fā)酵性能高、能在中低溫下快速發(fā)酵的菌株。紫外誘變是一種常規(guī)有效的菌株誘變育種方法，且操作簡(jiǎn)便，歷年來(lái)的試驗(yàn)表明，80%的有效誘變是通過(guò)紫外誘變獲得的。因此本研究以品質(zhì)優(yōu)良的高溫根霉菌株8為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變，獲得一生長(zhǎng)性能良好、具有廣溫特性的菌株1。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌 種 8號(hào)菌株，湖南省土壤肥料研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 儀 器 100套培養(yǎng)皿，若干支10 mL移液管，若干支1.0 mL移液管，100 mL錐形瓶若干個(gè)，250 mL錐形瓶若干，量筒，紗布，接種環(huán)，酒精燈，玻璃刮鏟，紅光燈，紫外燈，滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，磁力攪拌器，分光光度計(jì)。

1.2 培養(yǎng)基

菌株的培養(yǎng)選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 出發(fā)菌株的選育 菌株選擇主要結(jié)合產(chǎn)品的色、香、味、形，一般要求它生長(zhǎng)速度快、不產(chǎn)生有害物質(zhì)、培養(yǎng)方便、酶系復(fù)雜（不僅含蛋白酶，還含有其他酶類），且酶活性高、發(fā)酵速度快，菌種純、性能穩(wěn)定，產(chǎn)品風(fēng)味好。生產(chǎn)菌株8符合以上要求，可作為出發(fā)菌株。

在無(wú)菌操作下將試管根霉菌原菌株制成孢子懸浮液，并用無(wú)菌毛細(xì)管取孢子懸浮液點(diǎn)滴到無(wú)菌平板表面，每皿1～5滴，反轉(zhuǎn)倒置于25～28℃溫箱中培養(yǎng)24～72 h，每隔6 h觀察1次，選取生長(zhǎng)速度快、菌絲健壯、色澤一致、孢子形成快的單個(gè)菌落，挑取少許菌絲移入無(wú)菌試管斜面培養(yǎng)基上，在25～28℃恒溫箱中培養(yǎng)4～5 d后，置冰箱內(nèi)備用。

1.3.2 紫外光誘變 首先是在無(wú)菌條件下，從選好的臘八豆菌株中，用接種環(huán)挑取一定量孢子，放入無(wú)菌水中，震蕩10 min左右；再用移液管移取該種菌液10 mL放入已滅菌的空白培養(yǎng)皿中。然后利用紅燈照明和紫外光誘導(dǎo)，誘變時(shí)間分別為10、30、60、90、120、180、240 s，接種完畢用已滅菌玻璃刮鏟涂勻，將培養(yǎng)皿放在黑暗和室溫條件下培養(yǎng)3 d。1.3.3 菌株的篩選 將以上誘導(dǎo)各個(gè)時(shí)段生長(zhǎng)良好的菌株，在無(wú)菌條件下，將這些菌和出發(fā)菌株分別接種到平皿培養(yǎng)基上，放置在室溫下培養(yǎng)，仔細(xì)觀察比較，選出優(yōu)良菌株1。

1.3.4 淀粉酶活性測(cè)定 先配好淀粉培養(yǎng)基，再通過(guò)較高溫滅菌后，快速倒好平板，制成淀粉酶培養(yǎng)皿。在無(wú)菌條件下，將1和8這兩個(gè)菌的孢子分別接種在淀粉培養(yǎng)基上。每12 h觀察一次，比較其生長(zhǎng)速度、菌圈的大小。

1.3.5 氧氣含量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 分別將誘變菌株1和出發(fā)菌株8接種在含大豆的水溶液和不用水泡的濕大豆中，置30℃溫度條件下培養(yǎng)3 d，觀察是否有菌絲生長(zhǎng)及菌絲的生長(zhǎng)量（每50 g干大豆所得干菌絲的重量）。

1.3.6 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 將誘變所得菌株于真菌培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)八代后，將之接入相同量煮熟的大豆上，比較第一代與第十代菌種在煮熟的50 g大豆（干重）、溫度為20℃、培養(yǎng)時(shí)間3 d的菌絲生長(zhǎng)速度和形成氨基酸的量。

1.3.7 氨基酸含量的測(cè)定 用出發(fā)菌株8和誘導(dǎo)菌1作對(duì)照試驗(yàn)放入28℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d，讓其萌發(fā)長(zhǎng)菌。制成臘八豆后，測(cè)其氨基酸含量。氨基酸中的自由氨基與水合茚三酮共熱，產(chǎn)生紫色化合物，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，該有色物質(zhì)在570 nm下有最大吸收。再用紫外光分光光度計(jì)測(cè)定未知樣品中的氨基酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變?cè)囼?yàn)

2.1.1 紫外線誘變劑量的確定 選育了一株能在高溫下（38℃）生長(zhǎng)速度快、蛋白酶活性較高、菌絲粗壯，并處在相同生長(zhǎng)期的優(yōu)良菌株8，作為出發(fā)菌株，進(jìn)行紫外線誘變。

試驗(yàn)選擇 30、60、90、120、240 s等不同時(shí)間對(duì)孢子懸液進(jìn)行紫外線照射，結(jié)果（如圖1）顯示，劑量為30 s的誘變，因存活率高、誘變率低、菌苔多，不易找到誘變株；劑量為240 s的誘變即使正變率較高，但它的存活率較低，所以都不宜選用。經(jīng)過(guò)多次紫外線誘變?cè)囼?yàn)發(fā)現(xiàn)，以稍高劑量進(jìn)行紫外線誘變有利于獲得目的菌株。在距離30 cm時(shí)，照射時(shí)間以120 s為佳；通過(guò)多次試驗(yàn)證明，此劑量是最佳誘變劑量，效果最好。

圖1 紫外線照射時(shí)間與孢子死亡率的關(guān)系

2.1.2 紫外誘變結(jié)果 選取分別標(biāo)記為：2′—01，2′—02，2′—03，2′—04，4′—01，8′—01，8′—02 的誘變菌株進(jìn)行比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2′—01在較低溫度下，生長(zhǎng)速度（以滿管時(shí)間表示）和菌絲粗壯程度均優(yōu)于其他菌株。因此，以該菌株作為目的菌株，命名為誘 1，見(jiàn)表 1。

表1 不同溫度條件下誘變菌株的生長(zhǎng)比較

2.2 淀粉酶活性測(cè)定結(jié)果

接種培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上有菌株生長(zhǎng)，原始菌株的淀粉酶活性為72.21 U/g，紫外線誘變后誘-1的71.76 U/g，說(shuō)明它們都含有淀粉酶；誘變前后菌株的淀粉酶活性并無(wú)顯著增加或減少，表明紫外線在誘變過(guò)程中并未引起形成淀粉酶基因發(fā)生改變。

2.3 氧氣對(duì)菌株的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示：菌株誘變前后在水中（缺氧條件）的生長(zhǎng)遠(yuǎn)不及在空氣中（有氧條件）生長(zhǎng)得快、好；它們雖然都能在水中生長(zhǎng)，但其生長(zhǎng)量和生長(zhǎng)速度明顯受氧氣的制約。這說(shuō)明菌株在誘變前后都是好氧菌，氧氣不足將直接影響菌株的生長(zhǎng)發(fā)育，所以在生產(chǎn)過(guò)程中要注意保持氧氣的持續(xù)供應(yīng)。

表2 氧氣對(duì)菌株生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.4 誘變株的遺傳穩(wěn)定性

通過(guò)多次傳代培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在較低溫和室溫的條件下，誘1的長(zhǎng)勢(shì)要明顯優(yōu)于出發(fā)菌株8；在出發(fā)菌株8不生長(zhǎng)的條件下，誘變菌株能很好地生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟。說(shuō)明誘1的這種能在較低溫下生長(zhǎng)的性狀是可以穩(wěn)定遺傳的，見(jiàn)表3。

表3 誘變株的遺傳穩(wěn)定性

2.5 臘八豆氨基酸含量的測(cè)定

將分別培養(yǎng)3 d和6 d的臘八豆稱量、磨碎、定容、過(guò)濾，然后用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)得氨基酸含量，結(jié)果表明：用出發(fā)菌株發(fā)酵3 d和6 d后的臘八豆的氨基酸含量分別為1.178 mg和1.578 mg；用誘導(dǎo)菌株發(fā)酵3 d和6 d后的臘八豆的氨基酸含量分別為5.814 mg和17.54 mg?？梢?jiàn)誘變后菌株不僅溫度適應(yīng)性強(qiáng)，而且它的蛋白酶活性也得以提高，用其發(fā)酵，制作的臘八豆品質(zhì)也將有較大提高。

3 討論

民間傳統(tǒng)方法是無(wú)法大量生產(chǎn)臘八豆的，因?yàn)槊沟淖钸m生長(zhǎng)和發(fā)酵的溫度很低，而夏季溫度高，且自然環(huán)境中其他微生物的種類和數(shù)量是一年中最多的，同樣也是它們生長(zhǎng)繁殖最旺盛的季節(jié)。然而通過(guò)對(duì)根霉的紫外線誘變，選育出了誘變菌株1，并與出發(fā)菌株在相同條件下進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)誘變菌株在較低溫度下，能夠保持穩(wěn)定的較快生長(zhǎng)速度，同時(shí)，誘變菌株可以更好地分解黃豆中的蛋白質(zhì)使蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率升高，大大提高了臘八豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。這樣，有利于臘八豆的工業(yè)化生產(chǎn)，并為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了更為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、方便的優(yōu)良菌株。從微生物生態(tài)、生物學(xué)特性筆者發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前期主要是根霉菌體的生長(zhǎng)和蛋白酶形成，發(fā)酵后期主要利用根霉分泌蛋白酶使蛋白質(zhì)分解為各級(jí)肽類、氨基酸。由于根霉產(chǎn)生的淀粉酶在后發(fā)酵時(shí)能夠?qū)ⅫS豆中少量的碳水化合物分解成低分子物質(zhì)，增強(qiáng)了臘八豆的風(fēng)味，改善了臘八豆的品質(zhì)，且根霉的發(fā)酵溫度較高，避免了臘八豆生產(chǎn)的季節(jié)限制，提高勞動(dòng)生產(chǎn)率及設(shè)備利用率。利用根霉代替毛霉發(fā)酵制作臘八豆從工藝上是完全可行的，同毛霉比有其更大的優(yōu)勢(shì)。誘變菌株1是廣溫菌，可以克服出發(fā)菌株的高溫生長(zhǎng)特性，更加有利于臘八豆的工業(yè)化生產(chǎn)。

如果能利用好根霉和毛霉各自的優(yōu)點(diǎn)，用純種根霉與純種毛霉共同發(fā)酵，這樣可能得到的臘八豆風(fēng)味更好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高；利用誘變菌株1生產(chǎn)臘八豆是否對(duì)臘八豆有其他方面的影響，還有待于進(jìn)一步研究。

[1]鄔玉香，夏延斌，劉愛(ài)玲.大豆異黃酮在臘八豆生產(chǎn)中的穩(wěn)定性[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，（3）：237-238.

[2]潘志芬，潘開(kāi)文.加工對(duì)大豆異黃酮的影響[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，1999，20（1）：38-39.

[3]錢存柔，黃儀秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：北京大學(xué)出版社，2000.

[4]杜秉海.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1997.

[5]夏巖石，夏延斌，蔣立文，等.利用毛霉與根霉共生發(fā)酵生產(chǎn)臘八豆的研究[J].食品工業(yè)科技，2005，26（1）：96-98.