王光祥，尚佑軍，陳江濤，呂占祿，張克山，劉湘濤

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，甘肅蘭州730046）

羊口瘡（Orf）亦稱羊傳染性膿皰、羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎，是由羊口瘡病毒（Orf virus）引起的一種人獸共患接觸性傳染病。本病最早于1920年發(fā)現(xiàn)于歐洲，現(xiàn)已廣泛分布于全世界，以澳大利亞、新西蘭等國最為嚴重。我國吉林、甘肅、內(nèi)蒙古、陜西、西藏、四川、云南等主要養(yǎng)羊省區(qū)均有本病發(fā)生的報道。本病的病原為痘病毒科副痘病毒屬成員，可在牛和山羊的胚腎細胞、犢牛和羔羊的睪丸細胞培養(yǎng)中生長［1－3］。近年來，隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，羊只引種等交易頻繁，加速了該病在我國各省的發(fā)生，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

2009年11月中旬，湖北省通山縣某羊場有300多只1月～3月齡黑山羊羔羊發(fā)病，發(fā)病率達80%，主要表現(xiàn)為典型的口瘡癥狀，經(jīng)多種抗生素和驅(qū)蟲藥治療無效，1周后有40多只病羊死亡。為了查明病因并獲得致病毒株，本試驗對病毒進行了系統(tǒng)的分離鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株、病料 MDBK細胞株由本實驗室保存，病料采自湖北省通山縣某羊場發(fā)病山羊疑似羊口瘡唇部痂皮。

1.1.2 實驗動物 昆明乳鼠、3月齡兔子由本所動物場提供，6月齡黑山羊羔羊購自甘肅省某羊場。

1.1.3 試劑 LA Taq DNA 聚合酶、DNA 分子質(zhì)量標準、DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 取痂皮病料用無菌生理鹽水漂洗3次后剪碎、研磨并以無菌生理鹽水按1∶10（V／V）制成懸液，加青霉素、鏈霉素各2 000單位／mL，置－20℃凍融2次后4℃浸毒過夜，以3 000 r／min離心20 min，取上清液經(jīng)菌檢陰性后置－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒分離 挑選長成致密單層且形態(tài)完好的MDBK細胞，用提前預(yù)熱至37℃的DMEM液清洗細胞1次～2次，接種1.2.1處理好的病毒液1 mL，37℃感作30 min，加入DMEM維持液37℃繼續(xù)培養(yǎng)并逐日觀察細胞生長情況和細胞病變，同時設(shè)正常細胞對照。當細胞出現(xiàn)75%細胞病變時收毒，凍融3次后繼續(xù)傳代。若細胞在接種病料后4 d～5 d內(nèi)未出現(xiàn)病變則連續(xù)盲傳3代，若第5代仍未病變視為陰性。

1.2.3 病毒理化學特性試驗 取13代細胞病毒液，用5－IUDR（5－碘－2－脫氧尿苷）處理病毒液進行病毒核酸類型鑒定；用200 mL／L乙醚和50 mL／L氯仿處理病毒液進行脂溶劑敏感試驗；50℃水浴30 min進行病毒耐熱性試驗。分別用MDBK細胞在96孔板上測定病毒的TCID50，未處理的正常細胞設(shè)為對照。

1.2.4 動物接種試驗 將1.2處理并保存的痂皮毒液分別接種以下動物［4－5］：①乳鼠：皮下注射2日齡昆明乳鼠，0.1 mL／只，各接種5只，另設(shè)注射同劑量生理鹽水的5只乳鼠作對照。②家兔：背部及股內(nèi)側(cè)皮膚經(jīng)剪毛消毒后劃痕接種、腹部作皮內(nèi)注射待檢上清液，2 mL／只，各3只，另設(shè)注射同劑量生理鹽水的3只家兔作為對照。③羊：選3只6月齡黑山羊羔羊，將病料懸液劃痕接種口唇黏膜，背部及股內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射待檢上清液，共4處，每處接種0.5 mL，另設(shè)注射同劑量生理鹽水的1只羔羊作為對照。

1.2.5 分離毒株TCID50的測定 在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)MDBK單層細胞，將傳代細胞毒6代～17代細胞毒分別用常規(guī)方法測定TCID50，最后用Reed－Muench法計算 TCID50。

1.2.6 PCR測序及序列分析 根據(jù)GenBank中ORFV B2L基因序列 （登 錄 號：GQ328006.1，GU139356.1，GU320351.1），用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計擴增引物：P1：AAGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC； P2： ATCGCCGGCGTTAATTTATTGGTTTGC。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.7 分離毒PCR鑒定 用寶生物工程（大連）有限公司DNA提取試劑盒，按說明書從病料痂皮和傳代細胞病毒液中（第1代至第3代）提取DNA。以提取的病毒基因組DNA為模板，采用50μL的PCR反應(yīng)體系（LA Taq（5 U／mL）0.5μL；10×LA PCR buffer 5μL；d NTP （2.5 mmol／L）8μL；B2L上下游引物P1、P2各0.5μL；DNA 模板5μL；d H2O 30.5μL），擴增目的片段。反應(yīng)條件為95℃2 min；95℃1 min，59℃30 s，72℃1 min 30 s，35個循環(huán)；72℃10 min。取8μL PCR產(chǎn)物在8 g／L瓊脂糖凝膠上電泳，檢測擴增結(jié)果?；厥誔CR產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司測序。將測序結(jié)果進行BLAST比對分析，同時應(yīng)用DNA Star軟件的Meg Align軟件對分離株B2L基因的測序結(jié)果進行生物信息學分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離及傳代結(jié)果

病料懸液接種MDBK細胞后從第一代細胞出現(xiàn)細胞病變，病變時間出現(xiàn)在40 h左右，繼續(xù)傳到6代細胞病變時間更加規(guī)律，細胞病變時間出現(xiàn)在36 h以后，細胞病變表現(xiàn)為：胞核濃縮、變圓、團聚、拉網(wǎng)、最后脫落的現(xiàn)象（圖1和圖2）。對照細胞正常，收毒時間都維持在72 h以內(nèi)。繼續(xù)傳代至17代細胞病變規(guī)律，且隨著傳代次數(shù)的增加出現(xiàn)細胞病變也更加規(guī)律，將該病毒分離株命名為ORFV／HB／09。

圖1 MDBK對照細胞Fig.1 MDBK control cell

圖2 MDBK細胞產(chǎn)生細胞病變Fig.2 Cytopathic effect in MDBK cells

2.2 理化學鑒定結(jié)果

將第13代細胞毒經(jīng)5－IUDR、200 mL／L乙醚、50 mL／L氯仿、55℃水浴處理后，測定的TCID50分別為10－3.5、0、0、10－2.0，與未經(jīng)處理的相應(yīng)病毒液的 TCID50（10－5.2）相比，經(jīng)處理的病毒液的 TCID50均有不同程度的降低。

2.3 動物接種試驗

接種乳鼠，觀察1周，與對照相比均未產(chǎn)生明顯的臨床癥狀；接種家兔3 d后，在接種部位未出現(xiàn)水泡和膿皰，只出現(xiàn)丘疹狀紅斑；接種病料的羊只在接種后第2 d，在劃線接種部位出現(xiàn)紅斑，紅斑逐漸變?yōu)榍鹫詈托〗Y(jié)節(jié)，繼而成為水瘡。在接種后第4天唇部出現(xiàn)膿泡，而后形成疣狀硬痂（圖3）。

2.4 分離株各代次傳代細胞毒TCID50測定結(jié)果

分離株隨傳代次數(shù)的增加，病毒在MDBK細胞中的感染滴度逐步升高，但傳代至13代后病毒滴度增加緩慢，趨于穩(wěn)定（表1）。

2.5 PCR檢測結(jié)果及序列分析

以分離株第1代至第3代和原病料痂皮分別提取的病毒基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增出1 137 bp左右的目的基因片段，與預(yù)期的片段長度相符（圖4）。將該片段回收并測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST核酸序列搜索后與測序結(jié)果相似性較高的20個病毒核酸序列均為ORFV核酸序列。相似性最高的序列為臺灣株（EU935106.1、DQ904351.1），相似性均為99.0%。

圖3 接種山羊發(fā)生嚴重羊口瘡Fig.3 Severe orf lesions in inoculated goats

表1 分離株在MDBK細胞上的TCID50測定結(jié)果Table1 The results of isolated strain TCID50 in MDBK cell

將該分離株B2L基因全序列測序結(jié)果與國內(nèi)外發(fā)表的ORFV毒株相應(yīng)序列進行比較，應(yīng)用DNA Star軟件包中 Meg Align軟件的 Clustal V方法計算遺傳距離，根據(jù)遺傳距離繪制核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5）。BL21基因進化樹結(jié)果表明，與山羊分離株（EU935106.1）（DQ904351.1）的親緣關(guān)系較近。同時，與分離株同處于一個進化分支上的毒株均來源于山羊，另一大的分支上的毒株均來源于綿羊。

3 討論

病原分離鑒定是診斷羊口皰病的金標準，本試驗用MDBK細胞從自然發(fā)病山羊羔羊的痂皮病料中分離出1株病毒，傳代至17代，病毒傳代細胞病變良好。病毒理化學特性試驗結(jié)果表明，5－碘－2－脫氧尿苷（5－IUDR）對病毒有明顯的抑制作用，病毒對脂溶劑敏感、不耐酸堿、對溫度有一定的抵抗力、反復(fù)凍融毒價下降，表明該病毒核酸屬DNA型。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果分析表明，我們檢測到了特異性的ORFV B2L基因，結(jié)合動物回歸試驗結(jié)果證明所分離到的細胞毒株為痘病毒科副痘病毒屬的羊口瘡病毒。

回歸試驗結(jié)果表明細胞適應(yīng)毒能引起羔羊出現(xiàn)典型的羊口瘡癥狀，與臨床見到的病例吻合。本研究中臨床發(fā)病均為哺乳期羔羊或斷奶羔羊，未見成年羊。用該分離毒接種乳鼠未見臨床病變，這與國內(nèi)報道的相符［5］。同時用該分離毒接種家兔，在接種部位只出現(xiàn)丘疹狀紅斑，未出現(xiàn)水泡和膿皰，這可能是由于該分離毒毒力較弱所致。另外，本試驗用MDBK細胞分離的毒株，在經(jīng)細胞傳代時，前13代病毒滴度增加較快，但13代后病毒滴度增加較慢，13代～17代毒病毒滴度在5.5左右，趨于穩(wěn)定，病毒滴度不高。而分離羊口瘡病毒一般常用的細胞是牛、羊睪丸原代細胞，分離的病毒病毒滴度可達到6.0以上［5－7］。造成病毒滴度不高的原因是由于所選用的細胞系不同，還是由于毒株的原因有待于通過毒株對比試驗和在分子水平對其毒力基因進行分析等進一步證實。

該分離株與其他國內(nèi)外參考毒株B2L基因相應(yīng)部分核苷酸序列相似性比較結(jié)果表明，不同來源、不同分離株的B2L基因高度保守。因此，B2L基因可以作為羊口瘡病毒分子診斷靶基因，同時也可將該基因表達產(chǎn)物應(yīng)用于血清學診斷。

圖5 ORFV／HB分離株B2L基因的進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of B2L gene of ORFV／HB

目前，世界各國特別是養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達的國家，已用分子生物學的方法進行疾病診斷，并加緊進行病毒分子生物學研究和基因工程苗的研究工作［8－10］。我們利用MDBK細胞對羊口瘡病毒進行了分離鑒定，成功分離到一株羊口瘡病毒，為今后進一步研制羊口瘡疫苗和檢測試劑打下了良好的基礎(chǔ)，進而為該病的防控提供了技術(shù)保障。

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