張苗苗，王 丹

（1.湖北生物科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，湖北武漢430070；2.武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司，湖北武漢430070）

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒引起的包括多種家畜和野生動(dòng)物共患的一種急性傳染病。豬是該病毒的天然宿主和貯存者，常造成暴發(fā)性流行，妊娠母豬表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊，常以產(chǎn)死胎為主。新生仔豬感染后，可引起大量死亡，15日齡以內(nèi)死亡率很高，可達(dá)100%，3周齡～4周齡仔豬的發(fā)病率高達(dá)40%～60%，育肥豬感染本病毒后可引起輕微的發(fā)熱，呼吸道癥狀和生長(zhǎng)遲緩，后備及空懷母豬感染病毒后可引起不育癥，不發(fā)情、返情、屢配不孕等。公豬表現(xiàn)為睪丸腫脹、萎縮、失去種用能力。該病具有高度傳染性，易在豬群間不斷傳播，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因無(wú)有效藥物用于偽狂犬病的防控，對(duì)其控制主要依賴于疫苗免疫接種。而疫苗的效價(jià)（病毒含量）是始終困擾生產(chǎn)企業(yè)的問(wèn)題，病毒含量的高低決定了疫苗質(zhì)量的優(yōu)劣，影響病毒含量高低的因素有很多，其中溫度是一個(gè)不能忽視的重要因素。本研究通過(guò)對(duì)相同條件下生產(chǎn)的同一批次的偽狂犬病病毒HB－98株的病毒液抗原和凍干成品在不同溫度下保存的病毒含量進(jìn)行追蹤測(cè)定，進(jìn)一步了解該病毒的部分生物學(xué)特性，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供一些數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒 豬腎傳代細(xì)胞（IBRS－2），購(gòu)自武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），由武漢科前生物制品有限公司實(shí)驗(yàn)室制備。

偽狂犬病病毒TK－／gG－／LacZ＋突變株 HB－98株毒種，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物病毒室構(gòu)建；偽狂犬病病毒HB－98株病毒液和豬偽狂犬病活疫苗（HB－98株）成品，由武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 試劑和溶液 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO BRL公司，置2℃～8℃保存。

DMEM培養(yǎng)液：取DMEM 粉末13.5 g溶于950 mL雙蒸水中輕輕攪拌至完全溶解后加入3.7 g Na HCO3，用1.0 mol／L HCl調(diào)p H 至6.8～7.0，定容至1 000 mL，過(guò)濾除菌，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞生長(zhǎng)維持液：在DMEM培養(yǎng)液中加入20 mL／L的新生牛血清，100單位／mL的青霉素，100 μg／mL的鏈霉素，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

新生牛血清，購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，置－20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 保存期試驗(yàn) 將經(jīng)過(guò)無(wú)菌檢驗(yàn)合格的豬偽狂犬病病毒HB－98株病毒液抗原分裝于無(wú)菌小瓶，分別存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、3、7、14、21、28 d，以后每隔1周取出測(cè)定病毒含量；將經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)、真空度測(cè)定合格的豬偽狂犬病活疫苗HB－98株凍干成品分別存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、7、28 d，以后每隔1月取出測(cè)定病毒含量。

1.2.2 病毒組織培養(yǎng)半數(shù)感染（TCID50）測(cè)定 將待測(cè)病毒（凍干成品先用DMEM維持液恢復(fù)至原量）用DMEM維持液按10倍系列稀釋，即10－1、10－2、至10－10等。將100μL不同稀釋度的病毒液加入96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度8孔，然后加入消化分散的IBRS－2細(xì)胞懸液，稍微振蕩，然后置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察2次，逐日記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，按Reed－Muench法計(jì)算TCID50。

Reed－Muench法的計(jì)算：先計(jì)算出各稀釋度的病毒液引起病變和非病變的累積細(xì)胞孔數(shù)，按下述公式計(jì)算出距離比例。

距離比例＝（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－50%）／（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)）。

lg TCID50＝高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)＋距離比例×稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)

2 結(jié)果

2.1 偽狂犬病毒HB－98株病毒液的保存期試驗(yàn)結(jié)果

將偽狂犬病毒HB－98株病毒液分裝于無(wú)菌小瓶，分別存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、3、7、14、21、28 d，以后每隔1周取出測(cè)定病毒含量，結(jié)果見表1。

表1 偽狂犬病毒HB－98株病毒液的保存期試驗(yàn)（TCID50）Table1 The storage test of pseudo rabies virus HB－98 strain virus liquid（TCID50）

一般情況下，偽狂犬病病毒HB－9株病毒液毒價(jià)低于7.05效果會(huì)受到一定的影響，保存期試驗(yàn)表明，在2℃～8℃至少可存放3個(gè)月。但在－20℃以下存放病毒含量下降較快，故在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中病毒液的存放宜于2℃～8℃存放為宜，但為了保證效果，也宜控制在3個(gè)月以內(nèi)。

2.2 豬偽狂犬病活疫苗HB－98株成品的保存期試驗(yàn)

經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)、真空度測(cè)定合格的豬偽狂犬病活疫苗HB－98株成品分別存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、7、28 d，以后每隔1月取出測(cè)定病毒含量，結(jié)果見表2。

表2 豬偽狂犬病活疫苗HB－98株成品的保存期試驗(yàn)（TCID50）Table2 The storage test of pseudo rabies virus HB－98 product（TCID50）

一般情況下，偽狂犬病毒HB－9株病毒液毒價(jià)低于6.6效果會(huì)受到一定的影響，保存期試驗(yàn)表明，豬偽狂犬病活疫苗HB－98株成品在－20℃以下至少可存放18個(gè)月，病毒含量無(wú)明顯差異，但在2℃～8℃存放，隨著時(shí)間推移，病毒含量稍有下降，故在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)以－20℃以下存放為宜。

從表1和表2結(jié)果表明，在不同保存條件下不同時(shí)間病毒液的質(zhì)量是不一樣的。病毒液在－20℃以下保存一段時(shí)間病毒含量下降較快，而在2℃～8℃存放病毒含量下降相對(duì)較慢，故在實(shí)際抗原生產(chǎn)過(guò)程中宜采用2℃～8℃保存?zhèn)慰袢】乖貏e是進(jìn)行抗原儲(chǔ)備時(shí)盡量避免抗原反復(fù)凍融。而對(duì)于凍干后的成品疫苗，在保存期內(nèi)還是盡可能采用－20℃以下保存。

3 討論

病毒含量是衡量一個(gè)疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)非常重要的指標(biāo)，病毒含量的高低往往決定了疫苗效價(jià)的高低，也就決定了疫苗的質(zhì)量。在實(shí)際生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、使用過(guò)程中影響抗原或疫苗病毒含量的因素很多，溫度是最重要的一個(gè)因素。在抗原生產(chǎn)過(guò)程中，由于生產(chǎn)檢驗(yàn)需要一定的周期，生產(chǎn)出的病毒液抗原不可能立即投入到下道工序，必須經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的儲(chǔ)存；另外，不同廠家可能由于產(chǎn)能的限制，需要進(jìn)行一定數(shù)量的抗原儲(chǔ)備，故需要對(duì)抗原進(jìn)行一段時(shí)間的存放，這就必須要求合格的抗原在經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的存放后依然保持較高的病毒含量。本研究表明，病毒液抗原在2℃～8℃保存其病毒含量下降的要慢些。但在本研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，在風(fēng)冷冷庫(kù)中保存一段時(shí)間后抗原病毒含量下降較快，而相同的病毒液抗原在同一溫度冰柜中保存則病毒含量下降相對(duì)較慢。分析原因可能是風(fēng)冷冷庫(kù)有自動(dòng)化霜時(shí)間，在化霜時(shí)冷庫(kù)溫度是要上升的，這樣抗原溫度也隨之升高，這就相當(dāng)于將抗原進(jìn)行反復(fù)凍融，因此保存一定時(shí)間后其病毒含量下降很多。因此，在我們實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)盡量將抗原放置在溫度相對(duì)恒定的容器中保存，或在很短時(shí)間內(nèi)將其用完，盡量避免長(zhǎng)期儲(chǔ)存。對(duì)于進(jìn)入運(yùn)輸使用過(guò)程中的成品疫苗，在生產(chǎn)廠家由于其自身的硬件環(huán)境及管理措施比較到位，冷庫(kù)的溫度一般來(lái)講不會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，但在實(shí)際短途運(yùn)輸過(guò)程中，特別是在基層農(nóng)戶使用過(guò)程中，往往由于受實(shí)際情況的約束，不可能始終保證理想的保存溫度，本試驗(yàn)證明，短時(shí)運(yùn)輸也不會(huì)影響成品質(zhì)量，但也要盡量避免在高溫下暴露，這樣才能保證疫苗的質(zhì)量。

［1］方六榮，周復(fù)春，陳煥春，等.偽狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ＋突變株的構(gòu)建?。跩］.病毒學(xué)報(bào)，2001，17（1）：69－74.

［2］王革非.偽狂犬病病毒鄂A株gI基因的克隆和表達(dá)［D］.湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

［3］張振華，蔣國(guó)文.豬偽狂犬病的防制［J］.飼料與畜牧：規(guī)模養(yǎng)豬，2011.（8）：34－35.

［4］楊 毅，李文剛，饒 寶，等.豬偽狂犬病疫苗的研究進(jìn)展［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（3）：154－157.

［5］李圣志.如何正確接種豬偽狂犬病疫苗［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，2009，（2）：47.

［6］韓 偉，張 莉，鄢明華，等.偽狂犬病病毒TJ－1株生物學(xué)特性研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（1）：37－40.

［7］彭麗英，倪建平，張婉華，等.豬偽狂犬病病毒在不同細(xì)胞中增殖的研究［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（4）：67－69.

［8］楊慶芳.規(guī)?；i場(chǎng)豬偽狂犬凈化措施的研究［J］.中國(guó)畜禽種業(yè)，2011，7（12）：100－102.

［9］段玉鵬.豬偽狂犬病的診治［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2011，27（4）：146.

［10］呂德坤.淺談規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控及凈化［J］.北京農(nóng)業(yè)：下旬刊，2011（8）：40－41.