張文波，李宏睿，冷 闖，鄧舜洲＊

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

沙門(mén)菌是腸桿菌科中一類(lèi)分布廣泛、血清型眾多的革蘭陰性桿菌。其中有少數(shù)為致病菌，可引起多種動(dòng)物的胃腸炎（即食物中毒）、傷寒、敗血癥及腸道外局灶性感染，又以胃腸炎型最為常見(jiàn)。豬是其重要的儲(chǔ)存宿主。

仔豬副傷寒（Swine paratyphoid）是由豬霍亂沙門(mén)菌、豬傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌等沙門(mén)菌屬細(xì)菌引起的一種嚴(yán)重危害仔豬生產(chǎn)的傳染?。?］。主要引起豬的敗血癥、腸炎、肺炎和肝炎，也可使懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)。隨著養(yǎng)豬業(yè)的集約化和規(guī)?；l(fā)展，該病對(duì)豬場(chǎng)正常生產(chǎn)的不利影響越來(lái)越大。近年，由于豬場(chǎng)抗生素的濫用和不當(dāng)使用，沙門(mén)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，多重耐藥現(xiàn)象已成為該菌的主要特征之一［2］，對(duì)其防控的難度不斷加大。因而從臨床病例中分離鑒定沙門(mén)菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物，對(duì)防控該病有著重要的實(shí)踐意義。

2011年10月份開(kāi)始，江西南昌2個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的40日齡左右仔豬出現(xiàn)消瘦、腹瀉、食欲不振等臨床癥狀，采取注射豬瘟疫苗、慶大霉素等治療措施無(wú)效。本試驗(yàn)采用常規(guī)方法從該場(chǎng)病死仔豬的組織臟器中分離病原菌，并進(jìn)行生化鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，為防控該病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 江西南昌2個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)送檢的病死仔豬。

1.1.2 微量生化鑒定管和藥敏試紙 均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡昆明鼠，購(gòu)自南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 解剖病死仔豬，無(wú)菌采集肝臟和腸道，進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2.2 細(xì)菌分離 無(wú)菌條件下分別將病料劃線(xiàn)接種于兔血瓊脂培養(yǎng)基，37℃燭缸培養(yǎng)12 h～24 h，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落特征。

1.2.3 細(xì)菌的純培養(yǎng) 無(wú)菌挑取兔血瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，革蘭染色并劃線(xiàn)接種于新的兔血瓊脂培養(yǎng)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，革蘭染色，鏡檢；將純培養(yǎng)的菌落分別劃線(xiàn)接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落。

1.2.4 生化鑒定 從純培養(yǎng)物中挑取單菌落接種于普通肉湯中，220 r／min振蕩培養(yǎng)12 h，革蘭染色，鏡檢。按文獻(xiàn)［3］方法進(jìn)行生化鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 用滅菌棉簽將培養(yǎng)菌均勻涂在普通瓊脂培養(yǎng)基上，將藥敏試紙均勻貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.6 動(dòng)物試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行。取分離菌的肉湯培養(yǎng)物（濃度為1.5×108cfu／mL），分別以0.25 mL和0.5 mL的量通過(guò)腹腔注射接種小鼠，觀(guān)察其發(fā)病的死亡情況，同時(shí)腹腔注射普通肉湯培養(yǎng)液作對(duì)照。并對(duì)死亡鼠進(jìn)行剖檢和細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢

送檢的病死仔豬外觀(guān)消瘦、被毛粗亂、皮膚出現(xiàn)斑疹或紫色斑點(diǎn)、身體末端發(fā)紺；剖檢可見(jiàn)盲腸、結(jié)腸腸壁增厚，結(jié)腸黏膜覆蓋糠麩樣假膜，揭開(kāi)假膜可見(jiàn)出血點(diǎn)（斑）；肝腫大，表面有黃白色壞死點(diǎn)；心肌出血，淋巴結(jié)切面有出血點(diǎn)（圖1～圖5）。

圖1 仔豬消瘦 、皮膚發(fā)紅Fig.1 Piglet emaciation，skin redness

圖2 結(jié)腸腸壁增厚Fig.2 Colon wall thickening

圖3 結(jié)腸黏膜覆蓋糠麩樣物Fig.3 The bran－like material covering colonic mucosa

圖4 盲腸黏膜覆蓋糠麩樣物Fig.4 The bran－like material covering cecal mucosa

圖5 心肌出血；肝臟腫大，表面有黃灰色壞死點(diǎn)Fig.5 Myocaridial hemorrhage；Enlargement and surface yellow－gray necrotic points of the liver

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)特性

在血瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，呈現(xiàn)圓形、半透明、灰白色、微隆起、濕潤(rùn)、邊緣整齊、針尖大的露滴樣菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上，菌落均為圓形、光滑、邊緣整齊、無(wú)色半透明；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，菌落為無(wú)色的小菌落。取純培養(yǎng)進(jìn)行革蘭染色，鏡檢，可見(jiàn)無(wú)莢膜、無(wú)芽胞、散在的革蘭陰性短桿菌。與沙門(mén)菌的特征基本一致。

2.3 分離菌株生化鑒定結(jié)果

分離的6株菌均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和阿拉伯糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，賴(lài)氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、MR和硫化氫反應(yīng)陽(yáng)性，乳糖、蔗糖、VP和硝酸鹽反應(yīng)陰性，運(yùn)動(dòng)力檢查陽(yáng)性，與鼠傷寒沙門(mén)菌的生化特性一致。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌對(duì)阿米卡星、卡那霉素、頭孢噻肟極敏感，對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星高敏，對(duì)大觀(guān)霉素、恩諾沙星、利福平、四環(huán)素、頭孢氨芐為低敏，對(duì)阿莫西林、青霉素G、復(fù)方新諾明、林可霉素為耐藥（表1）。

2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

注射0.5 mL菌液的小鼠均在15 h內(nèi)死亡，注射0.25 mL菌液的小鼠均在48 h內(nèi)死亡。剖檢肺臟充血，肝臟腫大、出血，腹腔中有腹水，脾臟腫大，腸黏膜出血，腸系膜水腫。從死亡鼠的肝、心、肺中分離到與接種細(xì)菌生物學(xué)特性一致的細(xì)菌。對(duì)照組小鼠無(wú)任何異常表現(xiàn)，7 d后處死剖檢，內(nèi)臟無(wú)病變。表明分離菌有較強(qiáng)的致病性。

3 討論

沙門(mén)菌在自然界中的分布十分廣泛，也是一種重要的條件致病菌［5］，對(duì)畜禽健康養(yǎng)殖、人類(lèi)公共安全、食品安全都具有著重要的影響。尤其是近年來(lái)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，沙門(mén)菌的危害越來(lái)越嚴(yán)重。

根據(jù)送檢豬場(chǎng)的流行病學(xué)、臨床癥狀和病死豬的剖檢變化等，初步懷疑是仔豬副傷寒。無(wú)菌采集病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果分離的6株菌在普通瓊脂培養(yǎng)、血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和菌落特征均與鼠傷寒沙門(mén)菌的一致。

表1 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table1 The results of drug sensitivity test of isolate strains mm

沙門(mén)菌常存在豬體內(nèi)尤其是腸道內(nèi)，且腸道內(nèi)存在多種類(lèi)似菌群，因此從腸道和糞便中分離到沙門(mén)菌并不能證實(shí)是致病菌。只有證明分離的沙門(mén)菌有強(qiáng)致病性，才能確診是沙門(mén)菌?。?］。本次試驗(yàn)中，選擇大小2種劑量的分離菌肉湯培養(yǎng)物，接種小鼠。結(jié)果2倍劑量組的小鼠在接種后15 h內(nèi)全部死亡，單倍劑量組的小鼠在接種后48 h內(nèi)全部死亡，且可從死亡鼠中分離到與原分離菌生物學(xué)特性一致的細(xì)菌，表明分離的鼠沙門(mén)菌有強(qiáng)致病性，是引起豬場(chǎng)發(fā)病的病原菌。

張瑋等［8］采用直腸棉拭子從健康豬腸道內(nèi)分離到22株沙門(mén)菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌的耐藥性非常強(qiáng)，僅對(duì)部分第3代頭孢類(lèi)敏感，其中耐4種以上抗生素的多重耐藥菌株達(dá)90.9%。張琦等［9］對(duì)分離的豬源鼠傷寒沙門(mén)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌僅對(duì)先鋒噻肟、菌必治、呋喃妥因、頭孢呋肟等藥物有效，而對(duì)其他臨床常用的12種抗菌藥物均耐藥。Varga C等［10］檢測(cè)并比較了加拿大阿爾伯塔省922株豬源大腸埃希菌和922株豬源沙門(mén)菌對(duì)15種抗菌藥物的耐藥性，結(jié)果沒(méi)有l(wèi)種菌耐第3代頭孢菌素和喹諾酮類(lèi)藥物，70.2%的大腸埃希菌和28%的沙門(mén)菌耐2至多種抗菌藥物。其他的研究報(bào)道與國(guó)內(nèi)的大致相同［11－12］。這些研究結(jié)果說(shuō)明，目前規(guī)?；i場(chǎng)沙門(mén)菌的耐藥性正在不斷發(fā)生變化，且耐藥性逐漸增強(qiáng)。雖然抗生素在沙門(mén)菌的防控中發(fā)揮著重要的作用，但隨著養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用和不規(guī)范使用，細(xì)菌在藥物的選擇性壓力下，不斷發(fā)生變異，以適應(yīng)藥物環(huán)境，其中以多重耐藥和耐藥譜不斷擴(kuò)大最為常見(jiàn)［13］，且已成為目前沙門(mén)菌的主要特征之一。因此，分離鑒定沙門(mén)菌，了解其耐藥性及篩選藥物仍是防控沙門(mén)菌的重要方式。

本次分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株的耐藥性較強(qiáng)，且呈多重耐藥性。結(jié)果與文獻(xiàn)［14－15］報(bào)道的基本一致。但2個(gè)場(chǎng)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果不太一致，經(jīng)詢(xún)問(wèn)養(yǎng)殖人員得知，2豬場(chǎng)相鄰，且關(guān)系密切，平時(shí)的預(yù)防用藥和疫苗免疫程序幾乎相同，但2個(gè)場(chǎng)的發(fā)病早，用藥較多，導(dǎo)致對(duì)一些藥物的敏感度降低。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇卡那霉素肌注3 d，水中添加頭孢噻肟鈉和多維，連用7 d，同時(shí)加強(qiáng)消毒、飼養(yǎng)管理、減少應(yīng)激等綜合措施，除前4 d有豬死亡外，以后逐漸平穩(wěn)，然后再用乳酸諾氟沙星可溶性粉飲水5 d，豬群恢復(fù)正常。

隨著抗生素的大量使用，沙門(mén)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)；且沙門(mén)菌的血清型多達(dá)2 500多種［16］，使用疫苗防控的難度較大；近年，隨著規(guī)?；?、集約化的發(fā)展，以及疾病的演變，大部分豬群處于亞健康狀態(tài)，在應(yīng)激、免疫抑制等不利因素作用下，很容易發(fā)生沙門(mén)菌的繼發(fā)、并發(fā)感染。因此，豬場(chǎng)在防控沙門(mén)菌病時(shí)，應(yīng)在加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、定期消毒、通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選敏感藥物或其組合進(jìn)行藥物預(yù)防等綜合措施，才能取得較好的效果。

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