魏光河，李薇伊

（1.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶402460；2.重慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，重慶401121）

豬細小病毒病是由細小病毒科豬細小病毒（Porcine parvoviurs，PPV）引起的以初產母豬產死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，偶有流產，但經產母豬本身無明顯癥狀的一種豬繁殖障礙性疾?。?－2］。該病毒在世界范圍內廣泛存在并呈地方性流行，給生豬的繁殖、發(fā)展帶來了巨大的經濟損失，嚴重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展［3］。目前，免疫接種是豬細小病毒病的主要防控手段。有關豬細小病毒病防控措施的探討報道較多，影響豬細小病毒的抗體水平的因素也有報道，但應用具體數據佐證影響豬細小病毒抗體滴度及探討如何提高豬細小病毒抗體滴度的方法未見報道。本研究選擇臨床及實驗室常用的3種不同免疫增強劑，探討對豬細小病毒抗體滴度的影響，尋找提高豬細小病毒抗體滴度的新方法及措施，以期應用于生產實踐，并為研制高滴度豬細小病毒血清奠定基礎和提供技術支持。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 豬細小病毒滅活疫苗，批號1002003，齊魯動物保健品有限公司生產；鹽酸左旋咪唑注射液，批號20100201，四川鼎尖動物藥業(yè)有限責任公司；豬基因工程α干擾素，批號09102103，大連三儀動物藥品有限公司；蜂膠液，生產日期2010年12月28日，兩年有效期，綿陽蜂之吻蜂業(yè)生產；豬細小病毒乳膠凝集試驗抗體檢測試劑盒，批號100401，武漢科前動物生物制品有限公司。

1.1.2 試驗場址及試驗用動物 試驗豬場為西南大學榮昌校區(qū)西南養(yǎng)豬場；試驗用動物為從榮昌縣昌元鎮(zhèn)石河村一個體養(yǎng)豬戶購買的一窩12頭30日齡斷奶的健康榮昌仔豬。該榮昌仔豬及母豬均未免疫接種細小病毒疫苗，血凝抑制試驗檢測PPV均呈陰性。

1.2 方法

1.2.1 試驗用動物分組及免疫接種 將購買的仔豬轉入試驗豬場，觀察7 d，隨機分為4組，每組3頭，命名為干擾素組、蜂膠試驗組、鹽酸左旋咪唑組及單一豬細小病毒疫苗組。在單一細小病毒疫苗相同疫苗使用劑量基礎上，將干擾素、蜂膠和鹽酸左旋咪唑分別按表1第1次～第4次免疫添加的不同劑量，將其與豬細小病毒滅活疫苗混合，頸部肌肉注射于試驗豬。其中，第2、3、4次免疫接種均為上次免疫接種后的第7天進行；前3次每次免疫接種均在采血后進行，第4次采血在加強免疫接種后進行（表1）。

1.2.2 血樣的采集及血清的制備 前腔靜脈采血，按5 mL／頭／次分別于前3次免疫接種前采集血液，最后1次加強免疫接種后的第2天從前腔靜脈采集血液。采集鮮血轉入滅菌5 mL離心管（有蓋），編號，37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置10 min～15 min，后轉入4℃冰箱靜置。取上清液，5 000 r／min離心10 min，上清液轉入滅菌的1.5 mL離心管，即為制備的待檢血清，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體效價的檢測 參照何啟蓋等［4］建立的乳膠凝集試驗方法，根據豬細小病毒乳膠凝集試驗抗體檢測試劑盒說明書，按表2加樣及判讀結果。達到陽性凝集反應的血清最高稀釋倍數，即為血清的抗體效價。凝集反應強度標準：“＋＋＋＋”表示全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明；“＋＋＋”表示大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁；“＋＋”表示約50%乳膠凝集，但顆粒較細，液體較混濁；“＋”表示有少許凝集，液體呈混濁狀；“－”表示液滴呈原有的均勻乳狀。判定標準：當陽性對照血清加抗原呈“＋＋＋＋”凝集，陰性對照血清加抗原呈“－”凝集，抗原加稀釋液呈“－”凝集時，以呈現“＋＋”及其以上凝集反應判為陽性。

表1 3種不同免疫增強劑免疫程序及劑量Table1 The immunization programs and doses of three different immunopotentiators

1.2.4 3 種免疫增強劑對豬細小病毒抗體消長規(guī)律的影響

1.2.4.1 效價平均值的計算方法 參照姚火春等［5］所介紹的抗體效價平均值計算辦法，確定干擾素、蜂膠及鹽酸左旋咪唑分別作為豬細小病毒免疫接種時的免疫增強劑各組內試驗豬一免、二免及三免、四免的豬細小病毒抗體效價平均值，以及干擾素組、蜂膠組、鹽酸左旋咪唑組與單一豬細小病毒滅活疫苗組各組的豬細小病毒抗體效價平均值。

1.2.4.2 3種免疫增強劑對豬細小病毒的抗體消長曲線 以檢測3種免疫增強劑每組3個平行樣本的豬細小病毒抗體效價為基礎，計算出左旋咪唑、干擾素及蜂膠作為免疫增強劑監(jiān)測4次平均豬細小病毒抗體效價，以監(jiān)測時間為橫坐標，以對應的豬細小病毒平均抗體效價為縱坐標，作3種免疫增強劑對豬細小病毒抗體消長規(guī)律影響的動態(tài)變化曲線，并以單一細小病毒疫苗對照組作對照。

1.2.5 各免疫增強劑組間豬細小病毒抗體效價的分析 按1.2.5.1所述方法，同法計算出每種免疫增強劑最后一次免疫接種后豬細小病毒抗體效價的平均值，以此平均值為基礎，單一細小病毒疫苗對照組作對照，采取單因素分析法，統(tǒng)計分析各免疫增強劑組間對豬細小病毒抗體效價的差異。

1.2.6 免疫接種后豬細小病毒抗體效價個體間的差異性分析 以單一細小病毒疫苗對照組為對照，參照姚火春等［5］所介紹的抗體效價平均值計算辦法，確定每頭試驗豬只最后一次免疫接種后豬細小病毒抗體效價所對應的孔數，以此為基礎，采取多重比較法作最后一次免疫接種后各試驗豬只與單一細小病毒疫苗免疫接種豬只間的豬細小病毒抗體效價個體間的差異分析。

1.2.7 數據處理 試驗數據用 Microsoft Excel 2010統(tǒng)計處理軟件進行單因素及多因素統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 血清樣品

通過采集各試驗仔豬前腔靜脈血液，制備免疫接種前及免疫接種后各試驗仔豬的血清樣品各4份，共計48份待血清樣品。

2.2 3種免疫增強劑對豬細小病毒抗體消長規(guī)律比較

對采集的試驗前、免疫接種后第7天及以后每7 d的血清樣品進行乳膠凝集試驗，檢測各組試驗豬的豬細小病毒抗水消長規(guī)律（表2）。

2.3 3種免疫增強劑對豬細小病毒抗體效價的影響

從表2可以看出，添加了免疫增強劑組的試驗動物所產生的抗體效價都較單一細小病毒疫苗對照組高，蜂膠作為免疫增強劑相對于本次研究的其他兩種免疫增強劑來說免疫效果最好，豬細小病毒抗體效價最高，達到28，即1∶256，適合作為豬細小病毒疫苗免疫接種時的較好免疫增強劑；干擾素和鹽酸左旋咪唑作為豬細小病毒的免疫增強劑免疫效果較差，四免后平均效價均接近1∶128；低于蜂膠作為豬細小病毒免疫接種時的免疫增強劑效果。僅接種豬細小病毒疫苗的空白對照組豬細小病毒抗體效價在最后一次免疫接種后平均為1∶64，相對蜂膠組、鹽酸左旋咪唑組及干擾素組的細小病毒抗體效價要低。

表2 不同免疫增強劑豬細小病毒抗體消長規(guī)律Table2 The porcine parvovirus antibody titers in three different immunopotentiators

2.4 各免疫增強劑組間豬細小病毒抗體效價差異分析

采用單因素方差分析，干擾素、鹽酸左旋咪唑免疫增強劑組與單一細小病毒疫苗組所產生的豬細小病毒抗體效價比較，差異均顯著（P＜0.05），蜂膠組與單一細小病毒疫苗對照組抗體效價差異極顯著（P＜0.01）；干擾素與鹽酸左旋咪唑組差異不顯著（P＞0.05），干擾素與蜂膠組的豬細小病毒抗體效價差異顯著（P＜0.05），蜂膠組與左旋咪唑組的抗體效價差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 免疫接種后豬細小病毒抗體效價個體間的差異性分析

采用多重比較法將單一細小病毒免疫接種組各豬只最后一次免疫接種后的豬細小病毒抗體效價與干擾素組、蜂膠組、鹽酸左旋咪唑組的各試驗豬只最后一次免疫接種后的豬細小病毒抗體效價比較可知，免疫接種后，單一細小病毒免疫接種組3頭單個豬只的豬細小病毒抗體效價與干擾素組、蜂膠組及鹽酸左旋咪唑組的所有單個試驗豬只的細小病毒抗體效價個體間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

免疫接種時使用免疫增強劑，是提高被免疫動物特異性血清抗體效價的手段之一，免疫增強劑種類、免疫接種劑量、免疫接種途徑、免疫接種次數和免疫接種間隔時間的最佳選擇也與提高免疫動物特異性血清抗體效價緊密相關［6－7］，而母源抗體水平直接影響免疫增強劑的效果。通過試驗豬只的選擇及對試驗豬只豬細小病毒抗體水平的監(jiān)測結果顯示，所有試驗豬只包括對照組豬只的豬細小病毒抗體效價均為零，說明該批試驗豬只符合本次研究要求。

本研究選擇30日齡左右的9頭健康榮昌仔豬用蜂膠、鹽酸左旋咪唑和干擾素作為免疫接種豬細小病毒疫苗的免疫增強劑和3頭單一細小病毒疫苗對照組試驗豬的試驗中，用蜂膠作為免疫增強劑的試驗豬細小病毒抗體水平達到1∶32及以上，該組所有試驗豬的細小病毒抗體水平均高于單一細小病毒疫苗對照組至少一個梯度。這與王茹等［8－9］研究報道的蜂膠具有免疫增強作用，能促進血清蛋白和丙種球蛋白含量提高，提高抗體的特異性保護力等作用機理一致。在以鹽酸左旋咪唑為免疫增強劑的試驗組中，試驗豬的細小病毒抗體水平不及蜂膠組，但高于僅免疫接種豬細小病毒疫苗的空白對照組，說明鹽酸左旋咪唑對豬細小病毒疫苗具有一定的免疫增強作用。因為鹽酸左旋咪唑是咪唑的左旋異構體，在免疫方面具有雙重作用，一是恢復周圍效應細胞的功能，可使低活性的T細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的功能恢復到正常水平；二是誘導T細胞和粒細胞的分化成熟，T細胞轉變成致敏淋巴細胞，產生MAF和MIF等淋巴因子，進一步活化巨噬細胞［10］。干擾素作為動物機體感染疾病過程的一種產物，既能通過在細胞內合成具有不損害細胞本身且抗病毒作用的蛋白質（AVP）而具有很廣的抗病毒作用；還具備高濃度的IFN可抑制B細胞產生抗體和低濃度的IFN可促進抗體產生作用等免疫調節(jié)功能。本次研究表明，干擾素作為豬細小病毒免疫接種時的免疫增強劑，當最后一次加強免疫接種時，試驗豬只的豬細小病毒抗體滴度平均接近1∶128，比單一豬細小病毒疫苗免疫接種組的平均抗體效價1∶64相對高了一個梯度，應證了王忠海、曹瑞兵等［11－14］許多學者報道的干擾素的免疫調節(jié)功能。

隨著第4次3種不同免疫增強劑與豬細小病毒疫苗同時免疫接種試驗豬只，大部分試驗豬只的細小病毒抗體效價都有較為明顯的增加，尤以最后一次加強免疫接種后豬細小病毒血清抗體效價都較未免疫接種前明顯增高；另外，隨著免疫接種次數的增加，試驗豬個體間的豬細小病毒抗體效價則呈現出平行的或類似平行的增長關系。本試驗研究所測得的結果顯示，免疫接種次數的多少及免疫接種劑量的大小、是否使用免疫增強劑等直接影響豬細小病毒的抗體水平。

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