蔡國恩 張溥明 陸欽池 梁培基 葉欽勇

玻璃電極應用于腦片上研究癲癇一直被認為是金標準。然而，一種新的方法——多電極記錄(mμlti electrode arrays recording，MEA recording)——非侵入性的神經(jīng)細胞記錄被Thomas和Gross等[1-2]介紹進神經(jīng)科學領域的研究。多電極記錄技術應用于腦片記錄已經(jīng)超過10年時間，然而盡管其相對簡單，但是這種技術沒有被廣泛的應用于理論和藥理學研究[3-4]。

在實驗性癲癇研究中，低鎂誘導離體腦片的癲癇樣發(fā)作模型是一種被常用于離體研究癲癇的模型[5-7]。在本研究中采用傳統(tǒng)的由無鎂高鉀誘導的癲癇樣海馬切片作為研究對象，結合多電極記錄這項新技術，觀察多電極記錄運用于癲癇研究及藥物治療的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實驗過程

1.1.1 基本介紹 運用 MEA(mμlti Channel Systems MCS GmbH，German)(圖 1(a)(b))對 C57BL／6小鼠(鼠齡7～8周)的癲癇樣海馬切片的神經(jīng)細胞進行胞外記錄。

1.1.2 切片準備 實驗選用 7周的 C57BL／6小鼠(由中科院上海生命科學院動物中心提供)，雄性。實驗方法在先前已經(jīng)有描述[8-10]。將小鼠快速斷頭，快速浸入人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)，剝離顱骨和硬腦膜，取出腦組織，快速放入冰水混合ACSF中，迅速剝離出一側(cè)海馬，切成厚度為400 μm的海馬切片，然后快速移入ACSF中進行孵育，在室溫(25℃)前后孵育1 h以上才能進行實驗。

1.1.3 實驗記錄 用廣口吸管將一個海馬切片移到MEA上(圖1c)，調(diào)整好位置，然后用尼龍網(wǎng)固定切片。由蠕動泵將持續(xù)通于95%O2和5%CO2的混合氣體ACSF以2.5～3 mL／min的灌流切片(室溫25℃)。當用ACSF灌流10 min以上后，換用持續(xù)通于95%O2和5%CO2的混合氣體的無鎂高鉀ACSF灌流切片，以形成癲癇樣的海馬腦片(癲癇樣放電達到6次／min以上入選實驗組)，然后給予卡馬西平灌流30 min，給藥結束以后，再次給與無鎂高鉀的ACSF灌流40 min。神經(jīng)元發(fā)出癲癇樣波通過60道電極進行同時記錄，后由商業(yè)軟件(MCRack)對神經(jīng)元反應進行采樣，存儲于計算機硬盤中，以備離線分析。采樣頻率為10 kHZ。

1.2 信號提取及數(shù)據(jù)分析 此過程由商業(yè)軟件(MCRack)進行處理。動作電位提取出來以后，運用MATLAB進行進一步數(shù)據(jù)處理作圖。具體可以參見本實驗室以前發(fā)表的相關文章[11-13]。

2 結果

2.1 無鎂高鉀誘導腦片的癲癇樣放電特征 由MEA在此癲癇模型記錄觀察到，從開始給于無鎂高鉀灌流到開始出現(xiàn)癲癇樣放電的時間為：600±45 s(n＝8)。在出現(xiàn)相對大的癲癇樣放電事件之前一般都有出現(xiàn)相對較小的癲癇活動事件。場電位的幅值一般大于100 μV。經(jīng)過濾波后得到的癲癇樣放電的幅值在25～60 μV之間。

2.2 動作電位的檢測與提取 從癲癇樣海馬切片上得到的原始信號(圖2A)，經(jīng)過MCRack處理后得到的結果(圖2B)。在實驗過程中，在只有當發(fā)生如圖2A的癲癇樣放電的頻率大于6次／min的標本才入選，在我們進行的20多次成功的實驗中，觀察到了相似的結果，雖然每次實驗的海馬切片和電極陣列的相對位置隨機不固定的，但是在實驗和數(shù)據(jù)處理過程中觀察到了相似的放電模式圖2。

2.3 神經(jīng)元放電的時空變化 給予腦脊液灌流腦片很少觀察到有自發(fā)放電，給予無鎂高鉀腦脊液灌流以后，會先觀察到神經(jīng)元明顯的興奮性表現(xiàn)，出現(xiàn)少量的自發(fā)放電，經(jīng)過一段時間的持續(xù)灌流，出現(xiàn)大量放電。CA1和CA3的放電比較明顯，表明海馬切片的癲癇模型具有區(qū)域特異性(圖3)。

圖1 A.MEA：1.石英玻璃；2.連接板；3.玻璃環(huán)；4.電極區(qū)。B.MEA芯片電極陣列詳細排列。C.海馬在MEA上的位置

圖2 MEA上記錄到的原始信號以及經(jīng)過MCRack處理以后的信號

2.4 卡馬西平在對海馬切片的癲癇活動的影響文獻報道卡馬西平可以對無鎂高鉀誘導的癲癇活動起抑制作用。在給予卡馬西平按照濃度遞增順序(10 μM，30 μM，100 μM)的實驗中觀察發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加，癲癇樣放電被抑制得更加明顯，10 μM時海馬切片的放電基本保持不變，100 μM時海馬切片的放電基本被完全被阻斷(圖4)。同時我們觀察了苯妥英鈉對此癲癇模型的作用，發(fā)現(xiàn)1 mM的苯妥英鈉不能阻斷癲癇活動。

圖3 海馬切片的癲癇樣放電的區(qū)域特異性

圖4 不同濃度的卡馬西平對海馬切片的癲癇樣放電的抑制作用。A：示卡馬西平濃度為10 μM時c能量圖譜信號變化不大，說明腦片放電受抑制較弱；B：示卡馬西平濃度為30 μM時c能量圖譜信號輕度受抑制，說明腦片放電一定程度上受抑制；C：示卡馬西平濃度為100 μM時c能量圖譜信號基本消失，說明腦片放電受較強抑制

3 討論

長期以來，以玻璃電極為基礎的電生理技術已經(jīng)成為神經(jīng)科學研究的標準，對于神經(jīng)科學的發(fā)展有相當重要的貢獻。在癲癇的電生理研究中，一直以來都是通過玻璃電極來了解癲癇活動的，包括癲癇的發(fā)生機制以及藥理學研究，從而推動癲癇的研究的向前發(fā)展。然而MEA技術為癲癇的電生理研究提供一新的手段，它可以同時給與記錄和刺激，為癲癇的基礎和藥理學研究提供新的思路和新的方向。從神經(jīng)網(wǎng)絡學說角度來看，耐藥性難治性癲癇的形成多數(shù)是神經(jīng)網(wǎng)絡的重組導致的[7]。龍莉莉的研究觀察到匹羅卡品致癇大鼠海馬中間神經(jīng)元變化表明神經(jīng)網(wǎng)絡的重要性[14]。 而MEA對研究神經(jīng)網(wǎng)絡具有極大的相對優(yōu)勢。

無鎂高鉀的癲癇模型是一個傳統(tǒng)的模型，其通過不阻斷突觸間的NMDAR，而導致神經(jīng)元興奮，引起癲癇樣放電。在多電極陣列建立起癲癇模型，然后通過60個位點同步記錄，可以同時觀察到整個腦片的神經(jīng)元的放電反應情況。圖3可以看出在海馬各個分區(qū)其癲癇樣放電是不一樣的。隨著海馬癲癇樣放電時間延長，海馬各個區(qū)域的放電發(fā)生變化，但是仍然以CA3區(qū)為主要的放電區(qū)域。

卡馬西平是通過阻斷鈉通道起抗癲癇作用，在以往的研究中[8]，卡馬西平在此癲癇模型當中抑制了癲癇樣放電的發(fā)生。有許多學者通過玻璃電極在無鎂高鉀的海馬切片癲癇模型上得到的實驗結果也是 10 μM的卡馬西平基本上沒有起作用，30 μM、100 μM卡馬西平能使突觸后電位的幅度與頻率均減少。從本研究圖4可以觀察到卡馬西平隨著濃度增加，癲癇波逐漸被抑制，100 μM基本被完全抑制。

上述研究說明了我們在MEA上建立起無鎂高鉀誘導的海馬切片癲癇模型是成功的，并初步運用經(jīng)典的抗癲癇藥物驗證了此模型，展示了MEA研究癲癇的優(yōu)勢。我們相信多電極記錄是可以更加推廣應用于研究癲癇的新技術，但是需要進一步探索最佳的研究方法。

[1]Thomas CA Jr，Springer PA，Loeb GE，et al.A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells[J].Exp Cell Res，1972，74(1)：61-66.

[2]Gross GW. Simultaneous single unit recording in vitro with a photoetched laser deinsulated gold multimicroelectrode surface[J].IEEE Trans Biomed Eng，1979，26(5)：273-279.

[3]Steidl EM，Neveu E，Bertrand D，et al.The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays[J].Brain research，2006，1096(1)：70-84.

[4]Meyer T，Boven KH，Gunther E，et al.Micro-electrode arrays in cardiac safety pharmacology： a novel tool to stμdy QT interval prolongation[J].Drug Saf，2004，27(11)：763-772.

[5]Tancredi V，Hwa GG，Zona C，et al.Low magnesium epileptogenesis in the rat hippocampal slice： electrophysiological and pharmacological features[J].Brain research，1990，511(2)：280-290.

[6]Kojima H，Kowada M，Bragdon AC.Mechanism of electrographic seizμre generation in the rat brain slice in low magnesium medium： modulatory effect of interictal bursting on seizure generation[J].Jpn J Psychiatry Neurol，1991，45(2)：279-283.

[7]蘇婕，吳原，吳月娟，等.體外培養(yǎng)癲癇細胞模型中整合素α2 表達的變化[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2011，37(8)：482-485.

[8]Dost R，Rundfeldt C.The anticonvulsant retigabine potently sμppresses epileptiform discharges in the low Ca++and low Mg++model in the hippocampal slice preparation[J].Epilepsy research，2000，38(1)：53-66.

[9]Wan YH，Jian Z，Wang WT，et al.Short-term plasticity at primary afferent synapse in rat spinal dorsal horn and its biological fμnction[J].Neuro-Signals，2006，15(2)：74-90.

[10]Li ST，Matsushita M，Moriwaki A，et al.HIV-1 Tat inhibits long-term potentiation and attenuates spatial learning [corrected][J].Annals of neurology，2004，55(3)：362-371.

[11]陳愛華，周藝，龔海慶，等.小雞視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的反應特性：多電極記錄研究[J].中國科學(C 輯)，2003，33(1)： 82-88.

[12]Zhou Y，Liu X，Liang PJ.The dual-peak light response of ganglion cells in chicken retina[J].Brain research，2007，1138：104-110.

[13]Zhang PM，Wu JY，Zhou Y，et al.Spike sorting based on aμtomatic template reconstruction with a partial solution to the overlapping problem [J].Journal of neuroscience methods，2004，135(1-2)：55-65.

[1144]龍莉莉，肖波，宋延民，等.匹羅卡品致癇大鼠的海馬PV中間神經(jīng)元數(shù)目變化及其軸突出芽[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志，2011，37(1)：15-19.