劉志洋，王會(huì)芳，何海斌，劉 娜，王金萍，彭 雪，王子真，高俊濤 (吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林 132013)

有關(guān)腦片膜片鉗技術(shù)最早可追溯至1985年，美國(guó)的Gray和Johnston采用酶解撕裂法對(duì)豚鼠海馬腦片GABA受體通道進(jìn)行了研究。而將膜片鉗技術(shù)成熟地應(yīng)用于離體腦片神經(jīng)元?jiǎng)t是1989年，德國(guó)馬普研究所Edwards、Sakmann和日本京都大學(xué)Takahashi首次將微分干涉相差技術(shù)應(yīng)用到膜片鉗技術(shù)領(lǐng)域，并對(duì)大鼠(海馬，視皮層，嗅球，小腦，額葉皮層和脊髓等)、小鼠(海馬)、貓(視皮層)神經(jīng)元離子通道特點(diǎn)進(jìn)行了廣泛研究。近年來隨著膜片鉗技術(shù)的日益成熟，利用腦片研究神經(jīng)細(xì)胞的電生理活動(dòng)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其可以保留較完整的纖維聯(lián)系與空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)又能排除在體內(nèi)復(fù)雜的因素對(duì)其影響，使得研究變得簡(jiǎn)單化［1-2］。因此腦片在研究神經(jīng)病、癲癇、電生理反應(yīng)、微管相關(guān)蛋白tau表達(dá)及在各種條件下?lián)p傷程度等實(shí)驗(yàn)中有重要的應(yīng)用，腦片培養(yǎng)技術(shù)十分重要，腦片的制取和培養(yǎng)也越來越突出了它的重要性［3］。目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)開始發(fā)展幼鼠海馬腦片的技術(shù)，但可能因?yàn)楦鞣N不適條件或方法的不同［4］而產(chǎn)生誤差甚至是失敗，本文詳細(xì)介紹一種幼鼠腦片的制備步驟及制備的過程以及可能遇到并需要注意的問題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生1～2 d的Wistar乳大鼠由吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑

人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分(mmol/L):NaCl 126，KCl 3.0，KH2PO41.2，NaHCO326，CaCl22.5，MgCl23.3。(每 250 mL ACSF用量:10×Stock 25 mL;ddWater 225 mL;CaCl2600 μL;MgCl2325 μL);葡萄糖 0.45 g(pH 7.4)。

Cutting solution pH 7.4成分(g/L):Choline chlofide 167.5;KCl 1.94;CaCl275μL;MgCl21 050 μL;NaHCO321.8;NaH2PO41.5;Glucose 27;A-scorbate acid 25.7(每150 mL Cutting solution用量:10 × Stock 15 mL;ddwater 135 mL;CaCl275 μL;MgCl21 050 μL;Glucose 0.405 g;Ascorbate acid 0.039 g)。瞬間粘合劑(Loctite 404TM膠);振動(dòng)切片機(jī)(MA752 Motorised Advance Viborslice UK);腦片孵育槽;恒溫水浴鍋。

1.3 切片方法

將5%的瓊脂塊，裁成適當(dāng)大小，在振動(dòng)切片機(jī)(MA752型，Campden Ins，UK)標(biāo)本托上涂上少許瞬間粘合劑(404TM膠)，將修整好的瓊脂粘貼在標(biāo)本托上;制備250 mL ACSF，放在冰箱中，控溫于2～4℃，然后取100 mL燒杯，加入80 mL ACSF，通入混合氣體(95%O2+5%CO2)飽和，置于36℃的恒溫水浴鍋中;制備150 mL Cutting soluion，置于冰箱中控溫0～2℃，然后在切片槽中，加滿Cutting soluion，并通入混合氣體(95%O2+5%CO2)，待各溶液達(dá)到指定溫度后，使用乙醚麻醉動(dòng)物。

選用出生1～2 d的Wistar乳大鼠，乙醚麻醉下迅速斷頭取腦(留少許小腦，便于將大腦固定在瓊脂上)，將剝離好的大腦切平，置于混合氣(95%O2+5%CO2)飽和的4℃ Cutting Solution中，然后取出大腦，平齊放在刀片上，用濾紙吸干Cutting Solution，在標(biāo)本托涂上少許瞬間粘合劑(404TM膠)，然后垂直粘貼于在振動(dòng)切片機(jī)標(biāo)本托上。在4℃和供氧混合氣條件下，用振動(dòng)切片機(jī)將海馬沿長(zhǎng)軸順橫向的纖維走向切成厚為300 μm的薄片6～10片。切片時(shí)，振動(dòng)切片機(jī)切割速度調(diào)在3～4(約0.14 mm/s)，振動(dòng)頻率選9(約3 500 r/min)。然后將切好的腦片置于混合氣飽和的ACSF中，室溫下孵育0.5 h待用。

2 結(jié)果

腦片顏色觀察可見，健康腦片呈淡黃色，如果腦片變白則表明活性喪失。將制得的腦片放在紅外顯微鏡下觀察其形態(tài)，可以看出圖1細(xì)胞的外形輪廓清晰，軸突較為明顯，活性較高，而圖2由其他方法制備的細(xì)胞胞體較大，空泡、軸突消失，活性較差。因此比較得出由此方法制備的腦片活性較高。

圖1 細(xì)胞活性較好(40×)

圖2 細(xì)胞活性喪失(40×)

3 討論

腦片的完好制備，尤其是腦片的細(xì)胞活性狀態(tài)是膜片鉗實(shí)驗(yàn)成功的重要前提基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大量腦片制備過程的觀察，在動(dòng)物的選擇和腦片的制備細(xì)節(jié)上總結(jié)以下需要注意的問題。

動(dòng)物:一般選擇出生1～2 d的乳鼠。原因有三:一是幼年動(dòng)物顱骨軟，取腦快，冷卻也快;二是幼年動(dòng)物抗缺氧能力比較強(qiáng);三是幼年動(dòng)物腦細(xì)胞膜韌性好，易于形成高阻封接，而成年或老年動(dòng)物細(xì)胞脆性較大，顱骨較硬，不易封接和剝離。

麻醉:麻醉劑常用乙醚，其作用短暫，對(duì)動(dòng)物影響較小。采用不使用麻醉劑而直接斷頭的方法會(huì)引起動(dòng)物的應(yīng)急損傷，同時(shí)不符合動(dòng)物保護(hù)的要求。在本實(shí)驗(yàn)中，由于新生動(dòng)物非常小，也可使用冰凍昏迷法而無(wú)需使用麻醉劑。

取腦:取腦時(shí)間(從斷頭到將腦浸入Cutting Solution中的時(shí)間)對(duì)腦片制備影響較大，一般以1～3 min較好。為保證腦片的存活，必須自始至終堅(jiān)持無(wú)菌原則;分離大腦動(dòng)作要輕柔、迅速，整個(gè)分離、切片時(shí)間最好應(yīng)控制在5 min之內(nèi);在本實(shí)驗(yàn)中，由于采用全腦切片，冷卻時(shí)間應(yīng)控制在30～50 s內(nèi)。

切片(以NVSLM1型振動(dòng)切片機(jī)為例)相關(guān)注意事項(xiàng)為:(1)整個(gè)切片過程要求無(wú)菌操作，所有動(dòng)物、解剖器具、切片機(jī)、浴槽及其他溶液均需消毒處理;(2)振動(dòng)切片機(jī)在切割時(shí)刀片的振動(dòng)頻率要盡可能高，但應(yīng)以刀片不產(chǎn)生垂直振動(dòng)為準(zhǔn)，一般選擇振動(dòng)頻率為9(約3 500 r/min);(3)設(shè)定好所要切片的厚度后，務(wù)必將刻度盤鎖住;(4)對(duì)一般腦組織來說，切片厚度在300 μm為宜，因?yàn)槿裟X片太薄(＜150 μm)不利于細(xì)胞的存活，但如果腦片太厚(＞500 μm)，細(xì)胞不易得到充足的氧氣，細(xì)胞存活率也會(huì)降低;(5)加入浴液，一般切片在液面下1 mm左右深度進(jìn)行，液體溫度保持在0～4℃，并不斷通入氧氣混合氣;(6)振動(dòng)切片機(jī)在切割時(shí)刀片的切割推進(jìn)速度應(yīng)盡量慢些，以防止擠壓大腦;(7)不同部位的切片的頻率不一樣，需要注意;(8)刀片可采用不銹鋼刮胡刀片，裝片時(shí)要用酒精消毒，且刀片均為一次性使用，切完以后刀片抬高一點(diǎn)，再退刀片，這樣對(duì)腦片的活性大有幫助。

腦片孵育:(1)孵育的紗網(wǎng)選用尼龍絲襪面料制作，原則是透水性好、質(zhì)地光滑，腦片不易粘附;(2)采用醫(yī)用輸液器的細(xì)塑料管(帶有針頭)給予氧混合氣，為增大氣體與ACSF的接觸面積，要將針孔用鉗子夾扁，使氣體在ACSF中形成非常小的氣泡，同時(shí)還可以節(jié)省氧混合氣(95%O2+5%CO2);(3)處于孵育中的腦組織，需要在一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境下恢復(fù)，通入混合氣體時(shí)，氣流不應(yīng)過大，否則會(huì)很容易吹動(dòng)腦片組織，引起死亡。

［1］劉振偉.實(shí)用膜片鉗技術(shù)［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2006:168-175.

［2］康華光.膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用［M］.武漢:科學(xué)出版社，2003:100-103.

［3］劉振偉，李立君，劉傳繢.海馬腦片盲法膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)［J］.生理學(xué)報(bào)，2001，53(5):405-408.

［4］王 勇，朱小南，陳汝筑，等.新生大鼠海馬腦片培養(yǎng)方法［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2005，19(1):70-74.