徐瑞金 紀(jì)霞孫 元芬黎 霞潘茗

·基礎(chǔ)研究·

纈沙坦對家兔慢性冬眠心肌細胞中肝細胞生長因子水平和心功能的影響

徐瑞金 紀(jì)霞孫 元芬黎 霞潘茗

目的觀察纈沙坦對慢性冬眠心肌細胞中肝細胞生長因子(HGF)和心功能的影響。方法36只新西蘭大白兔用簡單隨機抽樣法分為3組:假手術(shù)組、慢性冬眠心肌組、纈沙坦組各12只。結(jié)扎冠狀動脈左室支制備慢性冬眠心肌模型，在此基礎(chǔ)上給予血管緊張素Ⅱ受體(AT1)的拮抗劑纈沙坦干預(yù)8周后，用多功能生理記錄儀檢測左心室功能，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定心肌組織中HGF含量，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測凋亡細胞。結(jié)果與假手術(shù)組比較，慢性冬眠心肌組左心室功能減退，心肌組織中HGF含量降低［(2.99±0.57)ng/g組織比(5.16±0.64)ng/g組織，P＜0.01］;與慢性冬眠心肌組比較，纈沙坦組心肌組織中HGF含量升高［(4.65±0.72)ng/g組織比(2.99±0.57)ng/g組織，P＜0.01］，細胞凋亡指數(shù)降低(99.45± 17.32比120.129±15.97，P＜0.01)，且與心肌組織中HGF含量呈負(fù)相關(guān)(r=－0.666，P＜0.01)，纈沙坦可抑制慢性冬眠心肌組織間質(zhì)纖維化，改善心功能(P＜0.01)。結(jié)論慢性冬眠心肌中HGF含量降低，纈沙坦可保護缺血心肌。

冬眠，心肌;肝細胞生長因子;細胞凋亡;纈沙坦

無論冠狀動脈慢性缺血還是急性心肌梗死(AMI)都會有大量慢性冬眠心肌(CHM)產(chǎn)生，CHM的存在會引起心功能降低、心律失常、再梗死從而增加心血管事件的發(fā)生率，因此越來越受到人們的關(guān)注，尋求一種有效的干預(yù)措施對治療缺血性心臟病具有重要的臨床意義。肝細胞生長因子(HGF)是間質(zhì)細胞衍生的一種能促進細胞有絲分裂的多功能因子，HGF存在于肝臟、腎臟等組織中。纈沙坦被證實可逆轉(zhuǎn)心肌梗死及梗死后心力衰竭患者的心室重構(gòu)，從而改善預(yù)后。但迄今為止有關(guān)纈沙坦對CHM作用的研究很少，其確切機制及對HGF影響國內(nèi)尚無相關(guān)報道。本研究采用開胸不全結(jié)扎冠狀動脈左室支的方法建立家兔CHM模型，探討纈沙坦對CHM組織中HGF、間質(zhì)纖維化及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔36只，雌雄不拘，體質(zhì)量2.2～2.8 kg，平均(2.5±0.3)kg，月齡5～6個月，由青島醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，經(jīng)檢疫證實為健康狀態(tài)。1.2分組和試劑儀器

將36只新西蘭大白兔按簡單隨機抽樣法分為3組:假手術(shù)組、CHM組和纈沙坦組各12只。主要試劑儀器:纈沙坦(北京諾華制藥有限公司，批號: x1269)，Maclab生理記錄儀(澳大利亞ADI公司)，圖像處理儀(美國GENE公司)，TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)、羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 CHM模型制備

將動物稱質(zhì)量，耳緣靜脈建立靜脈通路，硫噴妥鈉(30 mg/kg)靜脈麻醉達滿意狀態(tài)，四肢反射及角膜反射消失后將家兔仰臥位固定于兔臺上，30 min追加硫噴妥鈉(30 mg/kg)以維持麻醉效果，將針形電極分別刺入實驗動物右上下肢、左下肢連接Maclab/12s多功能生理記錄儀行心電監(jiān)護，沿胸骨正中切口開胸剪開心包暴露心臟，取冠狀動脈左室支距主動脈根部約1.5 cm處為結(jié)扎點，用6/0的醫(yī)用無創(chuàng)縫合針于左室支穿線不全結(jié)扎冠狀動脈左室支中下部(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎)。造成靶血管重度狹窄，手術(shù)成功標(biāo)準(zhǔn)為其支配區(qū)主要為左心室下壁心肌顏色變淡，同時Maclab/12s多功能生理記錄儀顯示Ⅱ、Ⅲ、AVF導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段壓低、T波倒置等心肌缺血表現(xiàn)(無ST段抬高等急性心肌梗死表現(xiàn))，以0.9%生理鹽水沖洗胸腔，放置引流條后關(guān)胸。術(shù)后1 d拔除引流條，青霉素80萬U肌肉注射3 d，送回動物中心，除假手術(shù)組外，其他兩組動物均予高脂喂飼(基礎(chǔ)飼料+1%膽固醇+3%豬油)8周;并且纈沙坦組動物術(shù)后第2天開始予纈沙坦溶解在水中喂飼，每天2次至8周后再次開胸。

1.4 血流動力學(xué)測定

術(shù)后8周所有動物再次麻醉開胸并肝素化，于心尖部用5/0無創(chuàng)線做一直徑為5 mm荷包，中心部插入1.5 mm帶針芯檢測管于左心室，拔出針芯后接檢測管并連至能量轉(zhuǎn)換器，接Maclab/12s多功能生理記錄儀，5 min待心臟穩(wěn)定后描記左心室功能指標(biāo)，左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、等容收縮期最大瞬間壓力升高速率(+dp/dt)、等容舒張期最大瞬間壓力下降速率(－dp/dt)，左心室發(fā)展壓(LVDP)=LVSP－LVEDP。

1.5 組織生化

將動物處死，立即取出心臟，在結(jié)扎線下方2 mm處剪取心肌組織(假手術(shù)組心肌組織取自正常心室與梗死區(qū)相對應(yīng)的部位)，放入冷凍管中置于液氮罐保存。檢測時將心肌組織勻漿后，4000 r/min離心10 min，取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測心肌組織中HGF含量。用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取數(shù)值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HGF含量。

1.6 凋亡細胞檢測

采用TUNEL法檢測凋亡細胞，具體操作步驟按說明書進行，細胞核染成棕褐色視為凋亡細胞。用Leica圖像處理儀在400倍鏡下選取6個視野測灰度值，細胞凋亡指數(shù)用灰度的差值表示。

1.7 心肌組織中羥脯氨酸含量檢測

從液氮中取出凍存的心肌稱取組織100 mg，先用眼科剪將心肌剪成碎沫放在勻漿管中，加入0.9%NaCl 0.9 ml用電動勻漿器高速勻漿15次(以上操作均在冰浴中進行)，勻漿后以3500 r/min離心10 min，取上清0.1ml加0.9%NaCl0.4ml稀釋成2%的組織勻漿，再根據(jù)羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)要求測定羥脯氨酸含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，組間比較采用方差分析(ANOVA)和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 家兔心肌組織中HGF含量的變化

與假手術(shù)組心肌組織中HGF含量［(5.16± 0.64)ng/g組織］比較，CHM組［(2.99±0.57)ng/g組織］和纈沙坦組［(4.65±0.72)ng/g組織］降低(P＜0.01);與CHM組比較，纈沙坦組心肌組織中HGF含量升高(P＜0.01)。與假手術(shù)組心肌組織中羥脯氨酸含量［(0.306±0.015)ng/mg組織］比較，CHM組［(0.654±0.048)ng/mg組織］和纈沙坦組［(0.403±0.053)ng/mg組織］升高(P＜0.05);與CHM組比較，纈沙坦組心肌組織中羥脯氨酸含量降低(P＜0.05)。

2.2 纈沙坦對CHM家兔心功能影響

與CHM組比較，纈沙坦組LVDP、+dp/dtmax和－dp/dtmax升高(P＜0.01)，但低于假手術(shù)組(P＜0.05)，見表1。

表1 各組血流動力學(xué)指標(biāo)測定(ˉx±s)

2.3 心肌組織中凋亡細胞表達

假手術(shù)組心肌組織中可見少量凋亡細胞，細胞凋亡指數(shù)(12.46±3.13);CHM組和纈沙坦組可見較多凋亡細胞，細胞凋亡指數(shù)分別為(120.13± 15.97)和(99.45±17.32)，纈沙坦組顯著低于CHM組(P＜0.01)，且與HGF含量呈負(fù)相關(guān)(r=－0.666，P＜0.01)，圖1～3。

3 討論

CHM是可逆性收縮功能異常的心肌，它的產(chǎn)生可造成左心室收縮功能持續(xù)性損害，而改善心肌灌注，可使其異常功能得到部分或完全恢復(fù)［1］。

HGF是間質(zhì)細胞衍生的多功能細胞因子，是重要的營養(yǎng)因子，既往研究表明，HGF能防止和逆轉(zhuǎn)肝臟、肺臟、腎臟組織損傷后的纖維化和具有抗細胞凋亡作用［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮、血管平滑肌細胞中也存在HGF及其受體(C-met)，并在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用［3-5］。

有研究成功地將攜帶HGF基因的慢病毒轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細胞(EPCs)中，協(xié)調(diào)EPCs和HGF促進血管再生和防止纖維化的作用，應(yīng)用于缺血性心臟病的臨床治療［6］。血管緊張素受體阻斷劑(ARB)類藥物對缺血心肌的保護近年來引起了人們的關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，CHM組較假手術(shù)組心肌組織中的HGF含量降低，局部組織中的HGF受到血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的調(diào)節(jié)，慢性心肌缺血后，心肌組織中的AngⅡ增高，AngⅡ可與HGF基因5'端驅(qū)動子序列中的AngⅡ抑制元件結(jié)合，下調(diào)心肌細胞、血管內(nèi)皮、纖維細胞的HGF mRNA表達。本研究顯示，與CHM組比較，纈沙坦組HGF升高，ARB類藥物在受體水平上直接阻斷AngⅡ，消除了AngⅡ?qū)GF的負(fù)調(diào)控作用，使HGF含量增高。發(fā)揮了抗細胞凋亡、促進血管再生作用［7-8］，從而逆轉(zhuǎn)和防止左心室重構(gòu)，改善心功能，實驗結(jié)果顯示纈沙坦組心功能有明顯改善。另外，ARB類藥物可以擴張動、靜脈，減少回心血量，降低左心室舒張末期壓力容積，降低肺血管阻力，減少心肌耗氧量，ARB類藥物還增加冠狀動脈血流，增加心肌氧供，此外，ARB類藥物可以增強心臟收縮能力，增加心輸出量，逆轉(zhuǎn)肥大心肌。

心肌組織間質(zhì)和血管周圍成纖維細胞增生導(dǎo)致膠原合成增多是心肌纖維化的主要原因，羥脯氨酸是機體膠原蛋白的主要成分之一，在正常膠原蛋白中含量約13.4%，在彈性蛋白中含量極少，而在其他蛋白則不存在。因此，心肌組織中羥脯氨酸的含量可以反映膠原的蛋白表達水平，組織中羥脯氨酸含量可作為衡量其膠原組織代謝和判斷纖維化程度的重要指標(biāo)。本實驗顯示，纈沙坦組較CHM組心肌組織中羥脯氨酸含量明顯減少，提示纈沙坦可抑制心肌纖維化，其環(huán)節(jié)可能包括:(1)直接抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)減少心肌膠原的合成。(2) Ca2+在AngⅡ致成纖維細胞合成膠原過程中起重要的介導(dǎo)作用，而纈沙坦可降低心肌組織Ca2+而減少膠原合成，適當(dāng)降低的Ca2+可提高膠原酶活性，加速膠原降解。AngⅡ還可與其受體結(jié)合抑制細胞生長［8］，這種作用部分是由激活的蛋白酪氨酸激酶調(diào)節(jié)，蛋白酪氨酸磷酸酶可導(dǎo)致血管緊張素受體(ATR)或生長因子激動的絲裂素活化蛋白激酶失活。纈沙坦可在受體水平上抑制AngⅡ與ATR結(jié)合而發(fā)揮抑制心肌細胞凋亡的作用進一步改善心功能，本實驗證實慢性冬眠心肌可造成左心室收縮功能降低，纈沙坦可改善左心室收縮功能。由于本實驗未測定家兔心肌組織中AngⅡ及其受體的含量，故上述推測還有待于今后的實驗進一步來證實。

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Effects of valsartan on hepatocyte grow th factor and left ventricular function in the rabbitmodel of chronic hibernating myocardium

XURui-jin，JIXia，SUN Yuan-fen，LIXia，PANMing.Departmentof Health Care，Municipal Hospital of Qingdao，Qingdao 266071，China

PAN Ming，Email:sdqdpm@163.com

ObjectiveTo study the effects of Valsartan on hepatocyte growth factor(HGF)and left ventricular function in the rabbitmodel of chronic hibernatingmyocardium.MethodsAtotal of 36 rabbits were random ly divided into three groups(12 in each group)，sham-group，chronic hibernatingmyocardium group and Valsartan group.The rabbitmodel of chronic hibernatingmyocardium was established by the left ventricle coronary artery ligation.HGF in chronic hibernatingmyocardium was determined by ELISA and cell apoptosis was detected by TUNEL.Valsartan group was given oral Valsartan for 8 weeks.Left ventricle hemodynamics wasmonitored by Maclab/12s multifunctional physiological dynamic instrument.Resu lts

Compared with sham-group，left ventricular function was decreased significantly and HGF was significantly lower［(2.99±0.57)ng/g tissue vs.(5.16±0.64)ng/g tissue，P＜0.01］in chronic hibernating myocardium group.HGF in Valsartan group was significantly higher［(4.65±0.72)ng/g tissue vs.(2.99 ±0.57)ng/g tissue，P＜0.01］than in chronic hibernatingmyocardium group.Themyocardial apoptotic cell in Valsartan group was significantly lower than in chronic hibernatingmyocardium group(P＜0.01)and was correlated negatively with HGF(r=－0.666，P＜0.01).ConclusionsThe content of HGF in chronic hibernatingmyocardium is low.Valsartan could protect ischemicmyocardium.

Hibernation，myocardial;Hepatocyte growth factor;Cell apoptosis;Valsartan

2012-05-11)

(本文編輯:譚瀟)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.015

266071青島市市立醫(yī)院保健科

潘茗，電子信箱:sdqdpm@163.com