雷玉 平管軍 郭亮 邢明青 王旭

·臨床研究·

冠狀動脈粥樣硬化患者外周血蛋白激酶C受體蛋白表達與冠狀動脈狹窄的關系

雷玉 平管軍 郭亮 邢明青 王旭

目的探討冠狀動脈粥樣硬化患者外周血蛋白激酶C受體蛋白(RACK1)的表達變化及與冠狀動脈狹窄程度的關系。方法入選初診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患者83例，根據(jù)冠狀動脈造影結果，采用冠狀動脈狹窄程度積分評價其狹窄程度。患者被分為4組:Ⅰ組(0分)即為對照組;Ⅱ組(1～10分);Ⅲ組(11～20分);Ⅳ組(＞20分)。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(realtime PCR)檢測所有患者外周血RACK1 mRNA的表達情況。結果Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的RACK1 mRNA表達水平均顯著高于Ⅰ組(t分別為10.62，12.90，14.00，均為P＜0.05)，而Ⅲ組和Ⅳ組又顯著高于Ⅱ組(t分別為9.40和10.74，均為P＜0.05)，Ⅲ組、Ⅳ組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.43，P＞0.05)。相關分析顯示，冠狀動脈粥樣硬化患者外周血RACK1 mRNA表達水平與冠狀動脈狹窄程度存在相關性，相關系數(shù)rs=0.59(P＜0.01)。結論RACK1在冠狀動脈粥樣硬化患者外周血中表達上調，且與冠狀動脈狹窄程度相關。

動脈粥樣硬化，冠狀動脈;蛋白激酶C受體蛋白;冠狀動脈狹窄程度積分;實時熒光定量聚合酶鏈反應

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是嚴重威脅人類健康的重要疾病，其病理基礎是冠狀動脈粥樣硬化。目前國內外已有大量針對其發(fā)病機制的研究，產(chǎn)生了脂質滲入學說、平滑肌突變學說、炎癥學說、內皮損傷學說、單核-巨噬細胞作用學說等多種學說來闡述冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。而研究冠狀動脈粥樣硬化發(fā)病的相關分子改變，有助于發(fā)現(xiàn)可能的治療靶點。蛋白激酶C受體蛋白(receptor for activated C kinase 1，RACK1)是一種分子量為36000的含β-螺旋槳結構的支架蛋白，是WD重復蛋白(含色氨酸-天門冬氨酸重復序列的蛋白)家族成員之一，調節(jié)多條細胞內信號轉導通路［1］。RACK1最初被鑒定為哺乳動物中蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的一種受體，協(xié)同βⅡPKC的胞內細胞信號通路［2-3］。而如今被視為一種胞漿內游離的支架蛋白，RACK1含7個WD40重復序列，通過不同的WD40位點，與細胞內多種蛋白相互作用，如PKC［4］、酪氨酸激酶、胰島素樣生長因子I［5-6］，參與細胞功能調控。目前，在動物中已發(fā)現(xiàn)80多種蛋白與RACK1相互作用，調節(jié)多條胞內信號通路［7-8］，并在酵母及植物RACK1的研究中取得了一些進展［9］。

PKC屬于細胞信號轉導中的磷脂酰肌醇信號傳遞途徑，其功能表現(xiàn)為調控基因的表達和細胞周期，控制細胞膜的多種功能，參與炎癥過程和免疫應答。研究表明，PKC升高在動脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮重要作用［10］，血管平滑肌細胞的增生和分化都伴有PKC活性的增強，而前者與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關［11］。RACK1作為PKC的1個錨合蛋白，是否在冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中亦發(fā)揮重要作用，目前尚未見此方面相關研究?，F(xiàn)已知RACK1廣泛存在于哺乳動物多種組織以及外周血中［12］，本研究通過檢測CHD患者血液中RACK1的表達情況，探討其與冠狀動脈狹窄程度的關系，以期探索CHD新的診療靶點。

1 對象和方法

1.1 研究對象

入選2011年1～7月在青島大學醫(yī)學院附屬青島市立醫(yī)院心內科初診為CHD的住院患者83例，年齡40～75歲，平均(62.3±9.6)歲。其中男性50例，女性33例。排除標準:嚴重肝、腎疾病及急、慢性感染性疾病、腫瘤、結締組織病、紐約心功能分機Ⅳ級及其他不適合參加者。

1.2 冠狀動脈狹窄程度評價

所有患者行冠狀動脈造影，根據(jù)美國心臟學會/美國心臟協(xié)會(ACC/AHA)冠狀動脈造影指南，采用Gensini評分系統(tǒng)對每支血管病變程度進行定量評定［13］。(1)根據(jù)冠狀動脈狹窄程度進行基本評分:將冠狀動脈狹窄25%、50%、75%、90%、99%和100%分別定為1、2、4、8、16和32分;(2)根據(jù)冠狀動脈病變部位確定評分系數(shù):左冠狀動脈主干×5;前降支近段×2.5，中段×1.5，心尖支×1，第一對角支×1，第二對角支×0.5;回旋支近段×2.5，鈍緣支×1，遠段× 1，后降支×1，后側支×0.5;右冠狀動脈近段×1，中段×1，遠段×1，后降支×1。以每一冠狀動脈的狹窄評分乘以該病變部位的系數(shù)，即為該病變的評分。一位患者如有多處病變，則各病變的評分累計總和為該患者冠狀動脈病變程度的總評分。根據(jù)最終積分將患者分為Ⅰ組(0分)、Ⅱ組(1～10分)、Ⅲ組(11～20分)、Ⅳ組(＞20分)，其中Ⅰ組為無冠狀動脈粥樣硬化的對照組。所有患者均簽署知情同意書，研究方案通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 RACK1 mRNA表達水平檢測

1.3.1 主要試劑(1)引物由美國Invitrogen公司合成，序列如下:RACK1引物上游為CACATTGGCCACACAGGCTATC，下游為TGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGA，擴增產(chǎn)物長度為124 bp;內參引物上游為GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游為TGGTGAAGACGCCAGTGGA，擴增產(chǎn)物長度為138 bp。(2)Trizol試劑購自Invitrogen公司。(3)realtime PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。(4)人淋巴細胞分離液購自北京Solarbio公司。

1.3.2 標本處理及RNA提取83例患者均于冠狀動脈造影術前1 d采靜脈血4 ml，用枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝，用人淋巴細胞分離液(Ficolli)分離外周血單核細胞后加入1 ml Trizol，經(jīng)典法提取外周血總RNA。1.3.3 cDNA制備提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，行反轉錄。20μl反轉錄體系包括:2 μl10×RTmix，2μl超純dNTP，2μl Oligo-dT15，1μl Quant Reverse Transcriptase，13μl模板RNA。37℃孵育1 h。

1.3.4 real-time PCR檢測25μl反應體系包括: 12.5μl SYBR Premix Ex Taq，0.5μl PCR Forward Primer，0.5μl PCR Reverse Primer，2μl DNA模板，9.5μldH2O。反應條件為:94℃預變性30 s，94℃15 s、59℃15 s和72℃30 s(38個循環(huán))，72℃延伸10 min。反應儀器為Rotor-gene3000 Real-Time PCR System。目的基因表達陽性的標本熒光定量擴增曲線呈現(xiàn)S型，陰性標本成不規(guī)則波浪線。以2－ΔΔCt表示樣品中目的基因mRNA相對表達量，其中ΔCt =樣本Ct均值－內參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt－(隨機陰性對照樣品Ct均值－該樣品內參Ct均值)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組患者臨床特征和基線水平比較

4組患者的性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙史等差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 各組樣本RACK1 mRNA的表達情況

經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，RACK1 mRNA相對表達量符合正態(tài)分布。Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的RACK1 mRNA表達水平均顯著高于Ⅰ組(t分別為10.62，12.90，14.00，均為P＜0.05);而Ⅲ組和Ⅳ組的RACK1 mRNA表達水平又分別顯著高于Ⅱ組(t分別為9.40和10.74，均為P＜0.05)，但Ⅲ組和Ⅳ組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.43，P＞0.05)，見表2。各組RACK1及GAPDH擴增曲線呈S型(圖1)，融解曲線為雙峰，排除非特異性擴增及引物二聚體的出現(xiàn)(圖2)。

2.3 RACK1 mRNA表達水平與冠狀動脈狹窄程度的關系

Gensini積分為不連續(xù)變量，兩者相關性分析采用Spearman等級相關，結果顯示4組樣本中，RACK1 mRNA表達水平與Gensini積分呈正相關，相關系數(shù)為rs=0.59(P＜0.01)。

圖1 各組RACK1及GAPDH熒光定量擴增曲線

圖2 各組RACK1及GAPDH熒光定量融解曲線

3 討論

本研究分析CHD患者與無冠狀動脈粥樣硬化者RACK1表達水平在外周血中的差異，并借助Gensini積分來分析RACK1表達水平與冠狀動脈狹窄程度的相關性。結果顯示，CHD患者外周血中RACK1 mRNA表達水平均顯著高于無冠狀動脈粥樣硬化者，提示RACK1在CHD患者外周血中表達上調。相關分析顯示，CHD患者外周血RACK1 mRNA表達水平與冠狀動脈狹窄程度存在相關性。

表2 各組樣本RACK1 mRNA表達水平及冠狀動脈狹窄積分(ˉx±s)

RACK1作為一種錨定蛋白，可以與細胞中多種信號分子結合，參與細胞內許多信號通路的轉導，從而在各種生命活動過程中扮演非常重要的角色，如細胞分裂、細胞凋亡、胞漿移動、細胞運動等。近年來的研究表明，異常表達的RACK1參與多種病理過程，如在口腔鱗癌、惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺鱗癌、乳腺癌中表達異常，與這些腫瘤的發(fā)生、轉移和臨床分期密切相關［14］。RACK1作為一種新發(fā)現(xiàn)的骨成型蛋白受體Ⅱ的相互作用蛋白，屬于一種肺動脈平滑肌細胞的反向調節(jié)因子，可能參與肺動脈高壓的發(fā)?。?2］。

現(xiàn)普遍認為有多種因素參與動脈粥樣硬化，而氧化應激、內皮細胞功能紊亂、細胞異常增殖和凋亡以及細胞外基質失調是其發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，其中NAD(P)H氧化酶、內皮源型一氧化氮合酶(endothelial-derived nitric oxide synthase，eNOS)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)則分別是這些環(huán)節(jié)中的關鍵酶［15］。PKC正是通過調節(jié)這些關鍵酶的活性及其表達，來參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。據(jù)此我們推測RACK1作為PKC的一種常見錨定蛋白，可能通過作用于PKC途徑，在冠狀動脈粥樣硬化疾病進程中發(fā)揮調節(jié)作用。典型的RACK1調控PKC的信號轉導過程如下:RACK1與活化態(tài)PKC結合，將PKC定位到40S核糖體上并磷酸化起始因子elF6，磷酸化的elF6從60S核糖體亞基釋放后允許60S亞基和40S亞基結合，從而形成80S核糖體并增強翻譯活性，調控目的基因的表達［16］。RACK1參與冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的具體機制尚不清楚，可能為RACK1表達上調，與PKC相互作用，使PKC介導的信號通路翻譯活性升高，從而導致NAD(P)H氧化酶、eNOS、MAPKs、MMPs等上述關鍵酶活性增高，進一步引起過度的氧化應激反應，內皮細胞損傷等不良過程，最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。此推測有待進一步動物實驗等后續(xù)研究證實，本研究結果為在冠狀動脈粥樣硬化發(fā)病中深入研究RACK1的作用機制和發(fā)展?jié)撛诘闹委煱悬c提供了理論依據(jù)。

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Expression of receptor for activated Ckinase 1 in peripheral blood and its relationship with the extent of coronary lesions in patients with coronary artery atherosclerosis

LEIYu-ping，GUAN Jun，GUO Liang，XING Ming-qing，WANG Xu.Department of Cardiology，the Affiliated Qingdao Municipal Hospital，Qingdao University Medical College，Qingdao 266071，China

GUAN Jun，Email:guanjun@medmail.com.cn
Thiswork was supported by a grant from Technological Fund Supported Program for Commonality of Qingdao (10-3-3-4-2-nsh)

ObjectiveTo explore the expression of receptor for activated C kinase 1(RACK1)in peripheral blood and its relationship with the extent of coronary lesions in patients with coronary artery atherosclerosis.MethodsA total of 83 patients with coronary artery atherosclerosis were enrolled. According to the results ofangiography，the extentof coronary stenosiswas evaluated by the coronary stenosis score.Patients were divided into four groups:groupⅠ(0 score，normal control group)，groupⅡ(1-10 scores);groupⅢ(11-20 scores)，and groupⅣ(＞20 scores).RACK1 mRNA expression in peripheral blood was detected by real-time polymerase chain reaction.ResultsThe RACK1 mRNA expression in peripheral blood in groupⅡ，groupⅢand groupⅣwere significantly higher than in groupⅠ(t=10.62，12.90，14.00，respectively，all P＜0.05).RACK1 mRNA expression in groupⅢandⅣwere significantly higher than in groupⅡ(t=9.40，10.74，respectively，both P＜0.05)，and there was no statistical significance between groupⅢand groupⅣ(t=1.43，P＞0.05).Correlation analysis showed that RACK1 mRNA expression in peripheral blood was positively correlated with the extent of coronary lesions(rs=0.59，P＜0.01).ConclusionsThe expression of RACK1 is up-regulated in peripheral blood in coronary artery atherosclerosis patients，and it is positively correlated with the extent of coronary lesions.

Atherosclerosis，coronary;RACK1;Gensini's degree integral;Real-time polymerase chain reaction

2012-01-11)

(本文編輯:譚瀟)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.007

青島市公共領域科技支撐計劃項目(10-3-3-4-2-nsh)

266071青島大學醫(yī)學院附屬青島市立醫(yī)院心內科

管軍，電子信箱:guanjun@medmail.com.cn