李超英 姜金慶 李鳳云 楊金明 吳世秀 劉明成

摘要：采用優(yōu)化的碳化二亞胺法制備睪酮（ＴＥＳ）人工抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線在ＰＢＳ中的線性檢測(cè)范圍為０．０９６～９２．２00 ｎｇ／ｍＬ，相關(guān)系數(shù)Ｒ２＝０．９７２ ２，半數(shù)抑制濃度（ＩＣ５０）為２．８00 ｎｇ／ｍＬ，最低檢測(cè)限（ＬＯＤ）為０．０３５ ｎｇ／ｍＬ；抗體與去甲睪酮的交叉反應(yīng)率為２２．３％，與其他檢測(cè)化合物的交叉反應(yīng)很小或忽略不計(jì)。羊尿２０倍稀釋后進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，其添加值與檢測(cè)值的相關(guān)系數(shù)為０．９８５ ２。因此，該免疫學(xué)方法可用于動(dòng)物尿液中睪酮?dú)埩羲降亩糠治觥?/p>

關(guān)鍵詞：睪酮；人工抗原；多克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ

中圖分類號(hào)：Ｓ８５９．７９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）16－3554-03

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ

ＬＩ Ｃｈａｏ－ｙｉｎｇ１，２，ＪＩＡＮＧ Ｊｉｎ－ｑｉｎｇ２，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｙｕｎ２，ＹＡＮＧ Ｊｉｎ－ｍｉｎｇ２，ＷＵ Ｓｈｉ－ｘｉｕ２， ＬＩＵ Ｍｉｎｇ－ｃｈｅｎｇ２

（１． Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ （ｉｃＥＬＩＳＡ） ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ （ＴＥＳ） ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＴＥＳ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ （ＥＤＣ） ａｎｄ ｔｈｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｉｎ ＰＢＳ ｗａｓ ｆｒｏｍ ０．０９６ ｔｏ ９２．２00 ｎｇ／ｍＬ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ （Ｒ２） ｗａｓ ０．９７２ ２， ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤ） ａｎｄ ＩＣ５０ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ０．０３５ ｎｇ／ｍＬ ａｎｄ ２．８00 ｎｇ／ｍＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｎｏｒｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｗａｓ ２２．３％ ａｎｄ ｓｌｉｇｈｔ ｏｒ ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｕｎｄｅｒ ２０－ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｅｅｐ ｕｒｉｎｅ， ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ０．９８５ ２ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｄｄｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＴＥＳ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ； ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ

類固醇激素是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類調(diào)節(jié)機(jī)體代謝功能的微量物質(zhì)，又稱化學(xué)信息素。此類物質(zhì)有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)同化作用，可以提高蛋白質(zhì)沉積，降低脂肪含量，從而提高飼料轉(zhuǎn)化效率［１］。睪酮是哺乳動(dòng)物體內(nèi)常見(jiàn)的具有雄激素作用的類固醇激素，它可以增加肌肉含量，提高骨骼強(qiáng)度，并在雄性生殖器官的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，因而在臨床醫(yī)學(xué)中得到應(yīng)用。外源性睪酮也被運(yùn)動(dòng)員非法使用，以提高比賽成績(jī)；養(yǎng)殖場(chǎng)使用睪酮激素后，可以提高經(jīng)濟(jì)效益。然而，長(zhǎng)期攝入睪酮類激素會(huì)導(dǎo)致消費(fèi)者內(nèi)分泌紊亂、性早熟，大大增加致癌、致畸的風(fēng)險(xiǎn)［２］。因此，自１９８６年以來(lái)，歐盟委員會(huì)就禁止在肉食性動(dòng)物養(yǎng)殖中以促進(jìn)生長(zhǎng)為目的使用自然或人工合成的激素，以保護(hù)消費(fèi)者可能因食用激素的殘留物或其代謝物而引起的發(fā)育問(wèn)題、神經(jīng)問(wèn)題、遺傳毒性和癌癥問(wèn)題［３］。睪酮傳統(tǒng)的理化檢測(cè)方法包括液相色譜－質(zhì)譜（ＬＣ－ＭＳ）［１，４］和氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ）［５］等方法。這些方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但樣品前處理繁瑣，不適合大批量的市場(chǎng)監(jiān)測(cè)要求。而免疫學(xué)檢測(cè)方法建立在抗體對(duì)抗原的分子識(shí)別上，其主要優(yōu)點(diǎn)是親合力高、快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物液體的小體積、大批量檢測(cè)，逐漸成為世界各國(guó)有毒有害殘留物快速檢測(cè)的方法之一［６］。

本研究以睪酮標(biāo)準(zhǔn)品為起始反應(yīng)物，經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)制備人工抗原，通過(guò)免疫新西蘭大白兔獲得兔抗睪酮的血清，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ檢測(cè)方法。該研究可以優(yōu)化液質(zhì)聯(lián)用和氣質(zhì)聯(lián)用等理化方法的樣品前處理過(guò)程，同時(shí)為免疫檢測(cè)試劑盒和試紙條的研制提供基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１試劑與材料

睪酮（ＴＥＳ）、１９－去甲睪酮、勃地酮、雌二醇、群勃龍、甲睪酮、醋酸氯睪酮等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Ｄｒ公司；碳化二亞胺（ＥＤＣ）、弗氏完全佐劑（ＦＣＡ）、弗氏不完全佐劑（ＦＩＡ）由美國(guó)Ｐｉｅｒｃｅ公司生產(chǎn)；Ｎ－羥基琥珀酰亞胺（ＮＨＳ）由日本株式會(huì)社生產(chǎn)；琥珀酸酐、牛血清白蛋白（ＢＳＡ，ＭＷ６７ ０００）、雞卵清蛋白（ＯＶＡ，ＭＷ４５ ０００）、羊抗兔酶標(biāo)二抗（ＧａＲＩｇＧ－ＨＲＰ）、透析袋等購(gòu)自華美生物工程公司，其他試劑均為分析純。

１．２儀器與設(shè)備

ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＭＫ３酶標(biāo)儀和ＧＳ１５Ｒ高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Ｔｈｅｒｍｏ公司）；ＤＵ８００核酸蛋白分析儀（美國(guó)Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）；ＳＺ－９７自動(dòng)三重蒸餾水器（上海雅榮生化儀器有限公司）；ＰＨＳ－３ＴＣ精密酸度計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）。

１．３人工抗原的合成

參照文獻(xiàn)［３］，采用優(yōu)化的ＥＤＣ兩步法合成ＴＥＳ人工抗原（圖１）。準(zhǔn)確稱?。裕牛?８８ ｍｇ溶于６ ｍＬ無(wú)水吡啶，然后加入１５０ ｍｇ的琥珀酸酐，５０ ℃避光攪拌反應(yīng)２４ ｈ。氮吹儀吹干吡啶，獲得淡黃色油脂狀物，５％ ＮａＨＣＯ３溶解后，用乙醚洗滌２次，然后用Ｈ２ＳＯ４進(jìn)行酸化。離心后棄上清液，殘余物用無(wú)水硫酸鈉干燥，并用乙醚重結(jié)晶搗碎，揮發(fā)干溶劑所得淡黃色固體物即為半抗原ＴＥＳ琥珀酸酯。

將３８ ｍｇ ＴＥＳ琥珀酸酯用３ ｍＬ Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）溶解后，加入１２ ｍｇ ＮＨＳ 和 ３８ ｍｇ ＥＤＣ，３７ ℃條件下避光反應(yīng)２４ ｈ。離心后取上清液逐滴加入到５ ｍＬ含６６ ｍｇ ＢＳＡ（或４０ ｍｇ ＯＶＡ）的ＰＢＳ緩沖液中，３７ ℃條件下避光振蕩反應(yīng)６ ｈ。反應(yīng)完成后先用蒸餾水透析３ ｄ，再用ＰＢＳ透析３ ｄ，紫外掃描透析液無(wú)小分子吸收峰時(shí)分裝于安瓿瓶中，－２０ ℃凍干保存。用ＤＵ８００核酸蛋白分析儀掃描人工抗原，進(jìn)行紫外掃描圖譜鑒定。

１．４多克隆抗體的制備

參照文獻(xiàn)［７］和［８］的方法，制備兔抗ＴＥＳ多克隆抗體。首免用等體積ＦＣＡ乳化免疫抗原，劑量為５００ μｇ／只（以載體蛋白含量計(jì)算）。以后每隔４周加強(qiáng)免疫１次，改用ＦＩＡ乳化，共強(qiáng)化免疫４次。５免后１０ ｄ心臟采血，室溫靜置２ ｈ，４℃過(guò)夜后離心，收集上清，飽和硫酸銨三步鹽析法純化抗體。多克隆抗體加入疊氮鈉（V／V，０．０２％）后分裝，－７０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．５免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立

間接ＥＬＩＳＡ和間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ操作程序參考文獻(xiàn)［９］。方陣滴定法優(yōu)化檢測(cè)抗原（ＴＥＳ－ＯＶＡ）濃度和多抗（ＴＥＳ ｐＡｂ）稀釋倍數(shù)，以Ｂ／Ｂ０值（Ｂ是標(biāo)準(zhǔn)品不同稀釋度時(shí)Ａ４５０nm值，Ｂ０是不加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)Ａ４５０nm值）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品不同稀釋度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，擬合建立間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行相關(guān)分析。靈敏度用ＩＣ５０值表示，代表標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)抗原偶聯(lián)時(shí)的半數(shù)抑制濃度；線性范圍表示最大信號(hào)值２０％～８０％的抑制率（ＩＣ２０－ＩＣ８０）；最低檢測(cè)限（ＬＯＤ）以ＩＣ１５值計(jì)算［１０］?？贵w特異性以交叉反應(yīng)率（ＣＲ）表示［３］，計(jì)算公式是：ＣＲ=■×１００%，ＣＲ越低，抗體特異性越強(qiáng)。

１．６添加回收試驗(yàn)

將２０ ｍＬ羊尿充分搖勻，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ后取上清液，然后用ＰＢＳ稀釋１０倍后直接檢測(cè)。用甲醇配制ＴＥＳ標(biāo)準(zhǔn)品母液，再用ＰＢＳ稀釋成不同的加標(biāo)濃度檢測(cè)液，比較添加值和ＥＬＩＳＡ檢測(cè)值之間的相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)），驗(yàn)證免疫學(xué)檢測(cè)方法的有效性。

２結(jié)果與分析

２．１人工抗原紫外特征

在２２０～４００ ｎｍ紫外光區(qū)分別對(duì)ＴＥＳ、ＢＳＡ和ＴＥＳ－ＢＳＡ進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果如圖２所示。ＴＥＳ的最大吸收峰在２４８ ｎｍ，ＢＳＡ的最大吸收峰在２７９ ｎｍ，而ＴＥＳ－ＢＳＡ人工抗原的特征吸收峰發(fā)生了明顯的偏移，其紫外光譜具有明顯的ＴＥＳ和ＢＳＡ疊加的特性，證明偶聯(lián)成功。

２．２間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)檢測(cè)抗原和多克隆抗體用量少的原則，選擇Ａ４５０ nm值為１．５～２．０左右時(shí)，檢測(cè)抗原和ＴＥＳ ｐＡｂ的最大稀釋倍數(shù)為理想工作濃度（數(shù)據(jù)未顯示），因此確定本試驗(yàn)體系ＴＥＳ－ＯＶＡ最佳包被質(zhì)量濃度為２ μｇ／ｍＬ，抗ＴＥＳ ｐＡｂ的最佳工作的稀釋度為１∶１０４。優(yōu)化的間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖３所示，該曲線的回歸方程式為ｙ＝－９．８１７ 0 ｌｎｘ＋４８．２３６ 0（Ｒ２＝０．９７２ ２），ＩＣ５０為２．８ ｎｇ／ｍＬ，表明ＴＥＳ ｐＡｂ具有較高的靈敏度。根據(jù)公式計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線在ＰＢＳ中的線性檢測(cè)范圍為０．０９６～９２．２00 ｎｇ／ｍＬ，最低檢測(cè)限為０．０３５ ｎｇ／ｍＬ。

２．３抗體特異性

特異性是免疫測(cè)定方法中的固有現(xiàn)象，通過(guò)測(cè)定各種物質(zhì)的ＩＣ５０值，然后計(jì)算其交叉反應(yīng)率（ＣＲ）。因此，在間接競(jìng)爭(zhēng)ＥＬＩＳＡ檢測(cè)過(guò)程中，用蛋白同化激素結(jié)構(gòu)類似物代替ＴＥＳ標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定不同競(jìng)爭(zhēng)物的ＩＣ５０值，計(jì)算交叉反應(yīng)率，結(jié)果見(jiàn)表１。從結(jié)果來(lái)看，去甲睪酮（２２．３％）與ＴＥＳ有較大的交叉反應(yīng)，這說(shuō)明ＴＥＳ甾環(huán)結(jié)構(gòu)上Ａ和Ｂ環(huán)對(duì)其性質(zhì)影響較大。而其他競(jìng)爭(zhēng)物的交叉反應(yīng)率很小或沒(méi)有，說(shuō)明其競(jìng)爭(zhēng)物的三維結(jié)構(gòu)差異較大。結(jié)果表明，該免疫學(xué)方法可用于ＴＥＳ殘留水平的檢測(cè)。

２．４添加回收試驗(yàn)

將羊尿稀釋２０倍后添加不同濃度的ＴＥＳ標(biāo)準(zhǔn)品溶液，比較添加濃度和檢測(cè)值之間的相關(guān)系數(shù)，其結(jié)果見(jiàn)圖４。由圖4可知，數(shù)據(jù)點(diǎn)分布于趨勢(shì)線的兩側(cè)，檢測(cè)回歸方程式為ｙ＝０．９１８ ６ ｘ＋１．４５６ ９（Ｒ２＝０．９８５ ２）。這表明本研究建立的ＥＬＩＳＡ檢測(cè)值具有較高的符合性，可用于動(dòng)物源樣品中ＴＥＳ含量分析的大量篩選。

３結(jié)論

人工抗原能否刺激動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)半抗原的特異性抗體，是判斷人工抗原合成成敗的關(guān)鍵。本試驗(yàn)利用合成的免疫原（ＴＥＳ－ＢＳＡ）對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，并對(duì)抗體進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，合成的人工抗原能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，獲得了較高效價(jià)的多克隆抗體，抗體的特異性好、親和力強(qiáng)，可滿足動(dòng)物性食品中ＴＥＳ的安全評(píng)價(jià)需要?？梗裕牛佣嗫寺】贵w的制備為建立體液中ＴＥＳ殘留檢測(cè)的ＥＬＩＳＡ方法及開(kāi)發(fā)ＴＥＳ快速檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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