張恒 陳勝喜 黃凌瑾

肺癌是目前世界上男女性發(fā)病率和死亡率均占第一位的惡性腫瘤，腫瘤患者中約25%死于肺癌[1]。近年來，世界上肺癌的總體發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)增加的趨勢。在目前的醫(yī)療條件下，早診斷早治療是提高肺癌長期生存率的非常重要的辦法。對于早期肺癌的治療，現(xiàn)在的方法已經可以取得理想的效果，因此重點即為如何做到早期診斷上面。

對人群特別是高危人群進行篩查是發(fā)現(xiàn)腫瘤最常用的手段。在肺癌的篩查上，痰細胞學檢查、影像學檢查和血清學檢查是三個主要的方向[2]。痰細胞學檢查簡便易行，但敏感性和特異性都很低，臨床應用價值極為有限。而對于影像學檢查，現(xiàn)階段的篩查意義并不明顯[3]。

血清學檢查是臨床上常用的檢查方法，易于接受，結果也很客觀。試圖以血清學檢查來達到診斷肺癌的目的基于如下的假設：肺癌細胞與正常細胞在蛋白表達譜、表達量方面均有差異，這些蛋白質可通過細胞分泌、細胞破裂等多種途徑進入血液，通過檢測肺癌細胞與正常細胞在蛋白表達質和量上的差異、進而篩選肺癌血清標志物是一種高效的肺癌診斷標志物篩選方法。

我們在以往的肺癌細胞蛋白質組學研究中發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞分泌蛋白是篩選肺癌血清標志物的重要來源[4,5]。然而，肺癌細胞分泌蛋白在在體情況下不一定出現(xiàn)在患者血液中，因此，對肺癌組織中溢出的可溶性蛋白進行研究將為肺癌血清標志物的篩選提供非常有益的線索。本研究試圖通過肺癌組織培養(yǎng)，進而對培養(yǎng)液中蛋白成分的通過蛋白質組學方法進行鑒定，從而篩選肺癌血清標志物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 鼠尾I型膠原（collagen type I，杭州生友），特級胎牛血清（Gibco），BrdU（BM0201，武漢博士德），小鼠抗BrdU IgG（ED1100，武漢博士德），即用型免疫組化試劑盒（SA1021，武漢博士德），Bradford蛋白定量試劑盒（Bio-Rad），ACN（色譜純）（Fisher），IPG strip（pH3-10L, 13 cm; pH4-7L, 13 cm）（Amersham Biosciences），Trypsin Gold（Promega），鼠抗人PACAP（ab67021）（Abcam）。

1.1.2 設備 PROTEAN II Xi Cell垂直電泳槽（Bio-Rad），IPGphor等電聚焦儀（Amersham Biosciences），Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS質譜儀（Applied Biosystem），UVS400型真空冷凍干燥儀（Savant speed Vac），Amicon Ultra-4 5KDa離心超濾管（Millipore），Mini-ProTEAN 垂直電泳槽（Bio-Rad），Power PAC 3000電泳儀（Bio-Rad）。

1.2 病例及標本

1.2.1 組織標本收集 術前病理學確診的肺腺癌患者6例，男:女為4:2，平均年齡52.2歲，肺癌分期II期2例，III期4例。在切下的肺組織中采集癌組織和距癌組織至少5 cm的肺組織，共6組。生理鹽水清洗干凈后，一部分用于組織培養(yǎng)，一部分置于-70oC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清樣本 收集于我院明確診斷的患者術前或治療前的血清標本共144例（患者基本資料見表1）。標本收集均得到患者許可。抽取動脈血5 mL于促凝管中析出血漿后，上清離心所得即是蛋白質樣品。保存于-70oC冰箱備用。

1.3 方法

1.3.1 組織培養(yǎng) 培養(yǎng)方法見文獻[6]。簡言之，取同一患者的癌組織和正常肺組織細切后分別置于鼠尾膠原配制成的膠原基質上進行組織培養(yǎng)，每一組均包括腺癌（Xca）、正常肺組織（Xf）（陰性對照組）、DMEM培養(yǎng)液組（空白對照組）。

1.3.2 組織溢出蛋白樣品采集 觀察肺癌組織及肺組織生長情況，從培養(yǎng)的第4天起至第14天每日更換培養(yǎng)液，更換的培養(yǎng)液先低速離心去除細胞及粗顆粒，再用濾器（0.22 μm）過濾，濾液于-70oC的冰箱里保存。使用時，將凍存的濾液先置于4oC的冰箱中解凍。再加入離心超濾管中離心。4 mL的樣品可濃縮為400 μL。蛋白樣品濃度測定采用Brodford法。先分別取1 mg/mL的雙乙酰胺：0 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL、20 μL，補實驗用緩沖水至終體積100 μL，加入1mL Bradford工作液并震蕩混勻，在5 min后測OD595值。得到標準曲線。再以同樣方法取1 μL樣品，分別加入99 μL的水，再補以Bradford工作液1 mL，進行樣品的OD值測定，再根據(jù)得到的標準曲線計算蛋白濃度即是樣品本身的濃度。

1.3.3 雙向凝膠電泳及圖像分析 按之前文獻[7]描述的方法進行。簡言之，分為腺癌組（Xca）和正常肺組織組（Xf），上樣量均為1.3 mg。蛋白樣品應用IPGphor IEFSystem進行一相等電聚焦，聚焦結束后，雙蒸水洗盡膠條背面的覆蓋液，平衡膠條，垂直SDS-PAGE電泳，至溴酚蘭指示線到達凝膠底邊處停止電泳。取出凝膠玻板，考馬斯亮藍染液染色。Image scanner將染色的凝膠掃描進計算機。借助圖像分析軟件PDquest進行成組匹配比較。選擇表達差異2倍以上的蛋白質點進行質譜分析。

表1 肺癌患者臨床及病理資料Tab 1 The clinical and pathologic data of lung cancer patients

1.3.4 質譜分析及生物信息學檢索 選取目標蛋白點，切下后每點加入脫色工作液50 μL，在37oC恒溫水浴箱中脫色30 min，然后超純水洗滌膠塊，ACN脫水，真空冷凍干燥儀中抽干1 h至膠塊完全干燥。每點加200 mmol/L NH4HCO3溶解的Trypsin（0.04 μg/μL）5 μL，置于37oC恒溫水浴中酶解18 h，取出離心管，吸出上清，加入20 μL萃取液覆蓋膠塊，37oC水浴30 min萃取，在真空冷凍干燥儀中濃縮至樣品體積約為2 μL-5 μL。然后在點樣板上的點樣孔中先后點上0.5 μL樣品和0.5 μL基質液的混合物，置于空氣中干燥后用0.1%TFA進行板上脫鹽，MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜儀）分析，Mascot Distiller軟件識別所獲得的 PMF（肽質量指紋譜）圖譜單同位素信號峰，將獲得的肽片段的質荷比（m/z）數(shù)值應用Mascot查詢系統(tǒng)對PMF進行檢索。搜索數(shù)據(jù)庫為SWISS-PROT和NCBInr蛋白質數(shù)據(jù)庫。

1.3.5 Western blot檢測 分別取培養(yǎng)液上清蛋白及血清蛋白按照文獻方法進行Western blot檢測：取50 μg樣品上樣，使用Mini-ProTEAN系統(tǒng)進行SDS-PAGE分離和轉膜（PVDF），脫脂牛奶封閉后，加入封閉液和一抗（PACAP 1:500），溫育2 h后，TBS-T液漂洗膜3次。再加入封閉液和二抗（單抗1:2,000），搖床上溫育1 h，用TBS-T液漂洗膜3次，每次10 min。ECL試劑發(fā)光顯影，X光片記錄。

1.3.6 ELISA檢測（雙抗體夾心法） 選取144例患者的血清標本，進行ELISA檢測。96孔酶標板用緩沖液洗滌后，每孔0.1 mL稀釋PACAP抗體包被，4oC過夜。次日，棄去孔內溶液，洗滌后，加一定稀釋的待檢樣品血清0.1 mL于上述已包被之反應孔中，37oC孵育1 h。洗滌（同時做空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔）。 加入新鮮稀釋的酶標PACAP抗體0.1 mL于各反應孔中。37oC孵育1 h，洗滌。加入臨時配制的TMB底物溶液0.1 mL于各反應孔中，37oC、10 min-30 min。加入2 mol/L硫酸0.05 mL于各反應孔中終止反應。在ELISA檢測儀上，于410 nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值。

1.4 統(tǒng)計學分析 使用SPSS統(tǒng)計分析軟件分析各組之間的差異。每組結果都用Mean±SD表示。采用配對樣本比較的Wilcoxon符號秩和檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗和多個獨立樣本兩兩比較的Nemenyi檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 凝膠電泳 共得到3個對照組共12份的總蛋白質考染圖譜各4張。經PDquest軟件分析及人工匹配，每張蛋白數(shù)在230個左右。經PDquest軟件處理后，共發(fā)現(xiàn)差異蛋白質點19個（表達差異2倍以上），差異點范圍集中在pI4-pI7和66 kDa-10 kDa之間。圖1是肺腺癌培養(yǎng)液上清蛋白（圖1A）及配對肺組織培養(yǎng)液上清蛋白（圖1B）雙向凝膠電泳考染圖譜。圖2是差異蛋白第6號點在雙向電泳時的差異情況。

2.2 差異蛋白質點的生物信息學鑒定 19個差異性蛋白質點經質譜儀分析和數(shù)據(jù)庫搜索，共鑒定14個（表2）。包括：α-烯醇酶（non-neural enolase, NNE）、磷酸丙糖異構酶（triosephosphate isomerase, Tim）、核苷二磷酸激酶A（nucleotide diphosphate kinase A, NDPK A）、兒茶酚O-甲基轉移酶2（catechol O-methyltransferase 2, COMT 2）；膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1, ANXA1）、膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2, ANXA2）、膜聯(lián)蛋白A4（Annexin A4, ANXA4）、凝集素-3（Galectin 3）、半胱天冬酶凋亡前銜接蛋白（proapoptotic caspase adapter protein, PACAP）；銅鋅超氧化物歧化酶（superoxide dismutase[Cu-Zn], SOD1）、谷胱甘肽-S-轉移酶 P（glutathione S-transferase P, GSTP1）；轉甲狀腺素蛋白（transthyretin, TTR）、乙基丙二酸腦病蛋白1（ethylmalonic encephalopathy protein1, ETHE1），PDZ和LIM結構域蛋白1（PDZ and LIM domain protein 1,PDLIM1）。有5個未能通過生物信息學方法鑒定。圖3是Xca凝膠圖中6號蛋白質點的PMF及Mascot搜索結果。

2.3 Western blot檢測 第6號蛋白質點是雙向電泳中發(fā)現(xiàn)的表達差異比較明顯的蛋白質，經鑒定是PACAP，已有的研究發(fā)現(xiàn)PACAP有一定的組織特異性，在腦組織中高表達，未見其在腫瘤患者血清中的研究。我們選取它作為進一步研究的對象，檢測了4組培養(yǎng)液上清及6組血清標本中PACAP的表達情況。結果見圖4、圖5。結果顯示PACAP在肺腺癌患者血清中的表達水平是它在健康人血清中的2.51倍-5.81倍，平均（3.56±1.16）倍。

圖1 肺腺癌培養(yǎng)液上清蛋白（A）及配對肺組織培養(yǎng)液上清蛋白（B）雙向凝膠電泳考染圖譜（圖中點1-19是人屬蛋白質）Fig 1 Coomassie blue dyed 2D Gel electrophoresis of conditioned medium of lung cancer tissue (A) and paired lung tissue (B) (Spot 1-19 are homo sapiens)

圖2 差異蛋白點6號在二維電泳中的表達情況局部圖（A代表腺癌組，B代表肺組織組）Fig 2 The partial detail of the sixth differential expressed protein spot in 2D Gel electrophoresis (A stands for lung carcinoma conditioned medium and B stands for that of lung tissue)

圖3 PACAP的PMF及Mascot搜索結果。A：通過MALDI-TOF質譜儀得到的肽指紋圖。B：搜索數(shù)據(jù)庫得到的與PACAP相吻合的5個肽段質譜峰。C：PACAP氨基酸序列，粗體字母代表質譜檢測到的肽段序列與PACAP的匹配情況。Fig 3 Identification of PACAP by peptide mass fingerprint. A: Peptide mass spectrum was obtained by MALDI-TOF mass spectrometry; B:The masses of five typical peptides were matched with PACAP by database searching; C: The sequence of PACAP is represented by single-letter code for amino acids. Sequence coverage by five peptides is indicated with bold capital letters.

2.4 PACAP ELISA檢測 肺腺癌血清PACPA的OD值是0.188±0.033，較肺小細胞癌（OD值為0.151±0.017）（P=0.002）、肺良性病變（OD值為0.154±0.023）（P＜0.001）和健康人（OD值為0.147±0.020）（P＜0.001）均高，差異具有統(tǒng)計學意義。肺腺癌和肺鱗癌之間OD值差別不明顯（P=0.704）。肺小細胞癌和肺良性腫瘤（P=0.939）以及健康人（P=0.346）之間OD值差別不明顯（表3）。

3 討論

我們選用前期成功建立的基于鼠尾膠原的組織培養(yǎng)模型進行腫瘤組織的培養(yǎng)，收集長勢良好的組織的培養(yǎng)液，先過濾壞死的細胞及其它雜質后，再進行二維電泳及蛋白質鑒定，經過PDQuest軟件比較匹配，發(fā)現(xiàn)19個表達差異的蛋白質，鑒定出了14個，其中9個表達上調，5個表達下調。鑒定的蛋白質PACAP在非小細胞肺癌患者的組織培養(yǎng)液中濃度明顯高于對照組，隨后我們用Western blot和ELISA檢測了血清標本中的PACAP情況，發(fā)現(xiàn)它在非小細胞肺癌患者血清中的表達情況明顯高于其它對照組，因此，我們認為PACAP可能是非小細胞肺癌潛在的血清標志物。

表2 Mascot軟件搜索數(shù)據(jù)庫鑒定出的蛋白質點Tab 2 Protein spots identified by Mascot software in database

表3 ELISA標本資料及血清中PACAP的ELISA檢測結果Tab 3 Clinical data and results of PACAP by ELISA analysis

組織細胞在人體內生長時，會與鄰近的細胞和胞外的基質建立復雜的生化和機械聯(lián)系，形成一個獨特的組織微環(huán)境。這個微環(huán)境就是普通的平面培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的最大區(qū)別之所在。正是它的存在使三維培養(yǎng)可以更加真實地模擬組織細胞在體內的生長情況。目前很多來自細胞生物學、生物化學以及藥理學等學科的研究發(fā)現(xiàn)，平面培養(yǎng)模式下的結果往往與真實情況存在差異，而且也越來越難以滿足新的研究要求，而以三維培養(yǎng)為平臺在耐藥性[8]、基因表達[9]等方面的研究結果已經與臨床情況非常接近。在前期的研究中，我們經過反復對比和挑選，最后成功建立了基于鼠尾膠原的組織培養(yǎng)平臺——一種易行的三維培養(yǎng)方式[6]。我們希望通過這個平臺，能在肺癌血清標志物的篩選上有新的發(fā)現(xiàn)。

蛋白質組學技術是分離和鑒別大量蛋白質的強有力工具，我們利用蛋白質組學技術分析3D培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)液上清，鑒定出了14個差異表達的蛋白質。它們大體上可以分為如下幾類：代謝相關蛋白，如NNE、Tim、NDPKA、COMT2；信號傳導蛋白，如ANXA1、ANXA2、ANXA4、Galectin-3、PACAP；抗氧化蛋白，如SOD1、GSTP1；轉運蛋白，如TTR、ETHE1；結構蛋白，如PDLIM1。這些蛋白中，NNE、Tim、NDPKA、ANXA家族、Galectin-3、SOD-1及GSTP-1在以往的研究中已發(fā)現(xiàn)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移有關系。

圖4 PACAP在4組肺腺癌（Xca）和配對肺組織（Xf）培養(yǎng)液上清中的Western blot結果Fig 4 Highly expressed PACAP in lung adenocarcinoma tissues conditioned medium. The expression levels of PACAP were compared by immunoblotting in conditioned medium between lung adenocarcinoma (Xca) and paired lung tissue (Xf).

圖5 PACAP在6組肺腺癌（Xca）和正常人血清（Xf）標本中的Western blot結果Fig 5 Highly expressed PACAP in lung adenocarcinoma serum. The expression levels of PACAP were compared by immunoblotting in serum between lung adenocarcinoma (Xca) and health people (Xf).

PACAP是本研究中發(fā)現(xiàn)的表達上調差異比較明顯的蛋白質，也未見到有相關文獻報道其與肺癌的關系，因此，我們選取它作為研究對象。PACAP作為一種凋亡調控相關蛋白，編碼基因位于5q23-q31，長度2,411 bp。它由189個氨基酸構成，分子量為20,694 Da，通過與Caspase-2和Caspase-9結合參與凋亡調控。它在細胞中定位于胞漿，呈彌漫性地顆粒樣分布于核周。PACAP有一定的組織特異性，在人腦組織中高表達，在其它組織中表達相對較低[10]。它有3種同分異構體，但只有一種具有完整的189個氨基酸序列。與很多凋亡通路成員不同的是，PACAP并不包含CARD（caspase recruitment domain）——這是很多Caspase和凋亡信號蛋白相互作用的結構。它包含的是一個名為WD40的氨基酸末端，這個末端的22個氨基酸形成一個P型的袢結構，發(fā)揮著信號肽的作用[10]。迄今為止，針對PACAP的研究極少，本研究使用差異蛋白質組學技術首次發(fā)現(xiàn)它在肺腺癌組織培養(yǎng)液上清中高表達，并采用ELISA檢測了它在不同人群共144例血清標本中的表達情況，發(fā)現(xiàn)它在肺腺癌和肺鱗癌患者血清中高表達，與它在小細胞肺癌患者、肺部良性疾病患者和健康人血清中的水平差異明顯。血清中的PACAP水平無法區(qū)別肺腺癌和肺鱗癌。在區(qū)分小細胞肺癌和肺良性腫瘤時，也沒有明顯的意義。一方面可能是本研究的小細胞肺癌樣本量少，無法代表群體情況，使結果出現(xiàn)偏倚，另一方面可能是由于小細胞肺癌的生物學特異性，分泌的PACAP確實不存在差異。

在采用蛋白質組學研究的過程中，經常出現(xiàn)找到的差異蛋白質點表達情況與隨后驗證結果不同的情況。因此，我們先直接選取培養(yǎng)液上清和人血清為研究對象，采用Western blot檢測來校正蛋白質組學的實驗結果。由于培養(yǎng)液上清和人血清樣品不同于細胞總蛋白樣品，沒有β-actin、β-tubulin等可供對比的內參。研究只能在保證上樣量一致的情況下，粗略比較目標蛋白的差異。這是國際上直接比較分泌蛋白和上清蛋白常用做法[11-13]。ELISA是一種定量檢測方法，在設置嚴格對照的情況下，得到的結果特異性好，靈敏度高，而且試驗流程較簡單，適合較大規(guī)模篩查。因此研究選擇ELISA進行例數(shù)較多的血清檢測。

本研究發(fā)現(xiàn)PACAP是非小細胞肺癌的潛在血清標志物。為了進一步明確PACAP在非小細胞肺癌診斷中的作用，后續(xù)還需要進一步研究PACAP與非小細胞肺癌分期的關系，更大樣本量檢測小細胞肺癌患者血清中PACAP的表達情況，對人群進行前瞻性的研究確定PACAP在診斷早期非小細胞肺癌上的效能，將PACAP與其它血清標志物聯(lián)合檢測爭取發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性更好的組合，PACAP與非小細胞肺癌預后和復發(fā)的關系?有關PACAP的生物學特性、PACAP為什么在非小細胞肺癌中高表達以及它在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到什么樣的作用也需要進一步的研究。