李白翎 鐘鏗 金磊 袁揚(yáng) 龔德軍 劉曉紅 黃盛東
肺癌已成為當(dāng)今世界發(fā)病率和死亡率增長最快且嚴(yán)重危害人類健康和生命的惡性腫瘤;而肺腺癌是肺癌中最常見的組織類型之一,且發(fā)病率逐年上升[1]。因此,對肺腺癌的研究顯得尤為重要。建立肺腺癌細(xì)胞系對于研究肺癌癌變、侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥的分子機(jī)制、生物學(xué)特征以及開發(fā)抗肺癌新藥等均有十分重要的理論和臨床意義。由于肺是一個開放性器官,其腫瘤組織易受細(xì)菌、霉菌的污染,較難培養(yǎng)[2]。我們利用1例原發(fā)性肺腺癌的腫瘤手術(shù)標(biāo)本,采用原代培養(yǎng)方法建立了一個新的細(xì)胞系Ch-Huang-1,為肺腺癌研究工作提供新的實(shí)驗(yàn)材料。
1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本取自長海醫(yī)院胸心外科46歲女性原發(fā)性肺腺癌IIIb期患者。病理診斷:右肺下葉低分化腺癌。支氣管斷端“-”,肺門淋巴結(jié)、第8組淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移“+”。
1.2 培養(yǎng)方法 將腫瘤標(biāo)本浸入含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中,送胸心外科實(shí)驗(yàn)室。在無菌條件下,用含有10%胎牛血清和青霉素及鏈霉素(各100 mg/mL)的PBS沖洗,剔除血管、包膜和壞死組織后剪成約1 mm3的組織塊,充分洗滌。在無菌條件下,將剪好的組織塊貼于含少量培養(yǎng)液的25 mL培養(yǎng)瓶壁上,每瓶10塊,置于37oC、CO2孵箱。4 h后接觸培養(yǎng)液,使組織塊浸于培養(yǎng)液中[3]。4 d后半量換液。20 d后出現(xiàn)細(xì)胞克隆,將克隆挑出,胰酶消化傳代1次。細(xì)胞長至80%左右傳代。早期細(xì)胞形態(tài)以貼壁細(xì)胞為主,多為大小不等的多邊形,核大,可見分裂相。分裂后細(xì)胞仍呈貼壁狀,細(xì)胞異質(zhì)性明顯。
1.3 生長曲線 取對數(shù)生長期的第5代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,稀釋成細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù),并調(diào)整濃度為每毫升細(xì)胞懸液含100,000個細(xì)胞,然后0.1 mL/孔(100個細(xì)胞)分別加入到24孔板的相應(yīng)孔中,并用完全培養(yǎng)基補(bǔ)足體積至0.5 mL。每天取出3個孔的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),連續(xù)9 d進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。以培養(yǎng)時間為橫軸,細(xì)胞數(shù)為縱軸,繪制生長曲線。
1.4 分裂指數(shù) 取第5代細(xì)胞懸液接種于事先放置有小蓋玻片的6孔板內(nèi),接種要求同生長曲線。每24 h取出一個玻片,按常規(guī)方法95%酒精固定,Giemsa染色。選擇細(xì)胞密度適中的區(qū)域觀察分裂細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。每個時間組的玻片各取細(xì)胞數(shù)多、中、少各一區(qū),共1,000個細(xì)胞。
1.5 克隆形成率 接種分散均勻的第5代細(xì)胞于6孔板中,每孔1,000個細(xì)胞,靜止培養(yǎng)2周-3周。當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時,終止培養(yǎng)。甲醇固定加適量Giemsa染色,計數(shù)克隆數(shù)。
1.6 組織起源鑒定 細(xì)胞懸液種到無菌載玻片,含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)至細(xì)胞完全伸展、貼壁,PBS洗,滴加SPC抗體,37oC、1 h,PBS洗,滴加FITC標(biāo)記的二抗,37oC避光30 min,熒光顯微鏡下觀察。
1.7 染色體分析 在第5代細(xì)胞的對數(shù)生長期加秋水仙素作用2 h,經(jīng)0.075 mol/L KCl低滲、甲醇-冰醋酸(3:1)固定處理,冰濕片滴片,室溫老化后用胰酶處理,Giemsa染色顯帶分析。
1.8 免疫缺陷小鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 在4周-6周齡小鼠背部皮下注射2×106個/0.2 mL收獲呈指數(shù)生長的培養(yǎng)細(xì)胞,1代-4代細(xì)胞60 d后仍不致瘤,傳至第5代才致瘤。1周時可觸摸到腫塊生長,觀察瘤結(jié)節(jié)形成情況。
2.1 形態(tài)現(xiàn)察 活細(xì)胞形態(tài)采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)細(xì)胞(圖1A),聯(lián)合采用機(jī)械刮除、反復(fù)貼壁等方法去除成纖維細(xì)胞,建立可傳代細(xì)胞系;倒置顯微鏡下細(xì)胞大小不等,癌細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布,細(xì)胞體積小,呈圓形,細(xì)胞鋪滿瓶底后有重疊現(xiàn)象。目前,所建立的肺腺癌可傳代細(xì)胞系已傳至第70代,細(xì)胞形態(tài)和生長速度不變。凍存后復(fù)蘇良好,可以認(rèn)為基本建系。從第2代傳代后細(xì)胞多呈多角形。少數(shù)為梭形或圓形(圖1B)。
2.2 生長曲線 生長曲線呈S型;在生長曲線的對數(shù)生長期取細(xì)胞數(shù)成倍生長的兩個點(diǎn)作垂直線測定時間,細(xì)胞群體倍增時間為36 h(圖2)。
2.3 分裂指數(shù) 分裂指數(shù)=分裂相細(xì)胞數(shù)平均值/總細(xì)胞數(shù)平均值(圖3),分裂指數(shù)曲線為倒V字型,培養(yǎng)第30小時處于分裂期的細(xì)胞最多。
2.4 克隆形成率 計算出克隆形成率:克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%,本研究克隆形成率為0.803%±0.078%。
2.5 組織起源鑒定 熒光顯微鏡下可以觀察到90%的培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)II型肺泡(alveolar type II, ATII)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白:疏水性表面活性蛋白C(surfactant protein C, SPC)(圖4),提示其起源于ATII細(xì)胞。
2.6 染色體分析 在顯微鏡下選擇分散良好且比較完整的第12代中期分裂象進(jìn)行觀察,計數(shù)100個分裂象的染色體數(shù)目。觀察到各細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目分布在35-44之間。染色體數(shù)目為亞三倍體,有明顯的染色體異常(圖5)。
2.7 免疫缺陷小鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 裸鼠皮下種植1代-4代細(xì)胞均不致瘤,傳至第5代后100%致瘤。4周瘤塊長至直徑約0.8 cm-1.0 cm左右時,用斷頸法將鼠處死(圖6)。常規(guī)HE染色觀察細(xì)胞生長旺盛,細(xì)胞核不均勻增大,異型性明顯,其組織學(xué)形態(tài)與原發(fā)瘤相似。目前傳代至第70代,致瘤效果未有衰退。
圖1 倒置顯微鏡光鏡觀察:細(xì)胞多呈多角形,少數(shù)為梭形或圓形(×200)。A:原代培養(yǎng)細(xì)胞;B:傳代細(xì)胞。Fig 1 Most cells were polygonal and a few were spindle or round (×200). A: primary cultured cells; B: passage cells.
圖2 細(xì)胞生長曲線圖Fig 2 Growth curve of cells line Ch-Huang-1
圖3 細(xì)胞分裂指數(shù)分析Fig 3 Analysis of cells division index
圖4 細(xì)胞組織起源鑒定(DAB,×200)Fig 4 Identification of the cellular tissue origin (DAB, ×200)
圖5 染色體核型分析Fig 5 Chromosomal instability in Ch-Huang-1
圖6 移植瘤癌細(xì)胞生長旺盛(HE,×40)。A:原代培養(yǎng)用組織塊;B:移植瘤細(xì)胞。Fig 6 Vigorous growth of transplanted tumor cells (HE, ×40). A: primary tissue culture cells; B:transplantation tumor cells.
應(yīng)用體外建立的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行研究,對揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制、尋找診斷腫瘤的有用指標(biāo)和探索實(shí)驗(yàn)性的治療方案都能提供十分有價值的參考資料。然而,成功建立一個原發(fā)腫瘤的永生化細(xì)胞系是很困難的。而作為一株合格的細(xì)胞系,應(yīng)當(dāng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)[4-6]:在體外培養(yǎng)半年以上,生長穩(wěn)定,能連續(xù)傳代;細(xì)胞生長特性明確;有遺傳學(xué)分析;腫瘤標(biāo)記物測定;異種成瘤性測定;無污染。我們利用術(shù)中取得的肺腺癌標(biāo)本,通過完整組織塊原代培養(yǎng)、皮下移植瘤模型構(gòu)建、皮下移植瘤原代培養(yǎng)等一系列方法建立腫瘤細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織塊法獲得肺腺癌原代細(xì)胞,為建立細(xì)胞系奠定了基礎(chǔ)。Ch-Huang-1細(xì)胞系至今在體外培養(yǎng)已經(jīng)超過1年,且生長穩(wěn)定,能夠連續(xù)傳代。Ch-Huang-1細(xì)胞系在體外培養(yǎng)過程中,接觸性抑制消失,重疊性生長,反映了腫瘤細(xì)胞惡性增殖的特點(diǎn)[7]。
本細(xì)胞系所描繪的生長曲線細(xì)胞呈"S”型,符合無限細(xì)胞系的特點(diǎn)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Ch-Huang-1細(xì)胞具有非貼壁依賴性生長特性,能夠進(jìn)行自主性增殖,表現(xiàn)出惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征[8]。通過細(xì)胞核型分析顯示:來源于人類的非整倍體細(xì)胞、多倍體細(xì)胞的出現(xiàn)代表著基因拷貝量的大量增加、核分裂加速、細(xì)胞增殖失控、核漿分裂失衡等細(xì)胞惡性增殖特性,異常染色體及端著絲粒等染色體結(jié)構(gòu)異??赡芘c細(xì)胞錨著獨(dú)立性生長能力、生長增殖優(yōu)勢及成瘤性等惡性細(xì)胞特性有明顯關(guān)聯(lián)[9-11]。本研究對細(xì)胞核型進(jìn)行分析后顯示該細(xì)胞系存在染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常。我們觀察到各細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目分布在35-44之間。染色體數(shù)目為亞三倍體,有明顯的染色體異常。這為以后從遺傳學(xué)角度尋找肺腺癌形成機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)資料。
本研究顯示我們所建Ch-Huang-1細(xì)胞系具有典型的惡性細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn);免疫缺陷小鼠經(jīng)接種細(xì)胞后產(chǎn)生移植瘤,其組織病理學(xué)特征與原發(fā)腫瘤特征一致。經(jīng)長期傳代培養(yǎng)其形態(tài)學(xué)、細(xì)胞動力學(xué)及染色體眾數(shù)等指標(biāo)無明顯改變,表明該細(xì)胞系生長穩(wěn)定,符合一般體外培養(yǎng)細(xì)胞系標(biāo)準(zhǔn)。
綜上所述,人肺腺癌細(xì)胞系Ch-Huang-1的建立可為深入研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為提供細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)P停檫M(jìn)一步開展分子生物學(xué)、免疫學(xué)及臨床診斷、治療等研究提供有利條件。