王婧 陳信義 侯麗 李莉 陸鴻飛 劉偉

肺癌是世界范圍內(nèi)腫瘤死亡的首要原因，約占肺癌80%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）在確診時(shí)大多已屬晚期，失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)，臨床以化、放療等綜合治療為主。但目前化療的療效似乎到達(dá)了一個(gè)平臺(tái)，其客觀有效率約30%，中位生存期8個(gè)-10個(gè)月，1年生存率30%-40%，且不良反應(yīng)較嚴(yán)重，多數(shù)患者難以完成有效的治療周期。因此，探求新的治療方法及策略對(duì)于提高NSCLC療效尤為重要，抗肺癌新生血管生成即是目前主要研究方向之一。中醫(yī)藥在治療NSCLC方面具有一定優(yōu)勢(shì)，前期研究[1-4]表明，綠茶的生物活性成分茶多酚（tea polyphenols, TPs）具有抗腫瘤效果，其機(jī)制可能與抑制腫瘤新生血管生成密切相關(guān)。

廣泛存在于真核生物中的核因子-κB（nuclear factorκB, NF-κB）是一種多功能的核轉(zhuǎn)錄因子；NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)控制多種細(xì)胞因子和生存基因表達(dá)，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、生存、轉(zhuǎn)移和血管生成具有一定的促進(jìn)作用[5,6]。環(huán)氧化酶（cyclooxygenase-2, COX-2）和Survivin是與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的重要蛋白分子。研究表明，腫瘤在缺氧狀態(tài)下促血管生成因子COX-2、VEGF等的表達(dá)受NF-κB調(diào)控。腫瘤特異性凋亡抑制因子Survivin在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中也持續(xù)表達(dá)。通過(guò)免疫方法抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的Survivin表達(dá)可明顯抑制腫瘤血管的生成，且大多數(shù)血管生成與抑制因子對(duì)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的作用都與調(diào)節(jié)Survivin的表達(dá)有關(guān)；而Survivin的表達(dá)主要是由AKTNFκB來(lái)調(diào)節(jié)的，因此NF-κB信號(hào)通路可能是腫瘤血管生成的主要通路之一。本研究以NF-κB信號(hào)通路為主線，檢測(cè)茶多酚對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤中NF-κB、COX-2、Survivin表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及細(xì)胞系 C57BL/6小鼠32只，6周-8周齡，SPF級(jí)，雌雄各半，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室繁育并提供。動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：京動(dòng)許字（1999）第015號(hào)；動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK京2009-0007，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏蔽系統(tǒng)輔以潔凈層流柜環(huán)境中飼養(yǎng)。Lewis肺癌細(xì)胞系，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所檢測(cè)中心常規(guī)保存并提供。

1.1.2 藥物 茶多酚由江西綠康天然產(chǎn)物有限責(zé)任公司惠贈(zèng)，純度98%；沙利度胺片為常州制藥廠有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字H32026129，產(chǎn)品批號(hào)10060512。

1.1.3 儀器與試劑 超凈工作臺(tái)系蘇州宏瑞凈化科技有限公司生產(chǎn)（型號(hào)SCW-CJ）；實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)系江蘇恒瑞制藥機(jī)械有限公司生產(chǎn)（型號(hào)LS150）；倒置顯微鏡系日本NIKON株式會(huì)社生產(chǎn)（型號(hào)TS100）；電熱恒溫培養(yǎng)箱系黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)（型號(hào)SKP-02.420）；包埋機(jī)系天津航空機(jī)電公司生產(chǎn)（型號(hào)BMJ-1）；石蠟切片機(jī)系天津航空機(jī)電公司生產(chǎn)（型號(hào)QPJ-1C）；奧林巴斯顯微鏡BX51。兔抗NF-κB抗體、兔抗COX-2抗體、兔抗Survivin抗體、兔SP檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒等購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與接種 液氮罐中取出含有Lewis肺癌細(xì)胞的凍存管，放入37oC水浴內(nèi)，使其溶化，吸取細(xì)胞懸液，加入離心管并滴加培養(yǎng)液至10 mL，1,000 r/min離心5 min，去上清液，加入PBS液后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×107個(gè)/mL，以0.2 mL接種于小鼠右腋窩皮下，待腫瘤長(zhǎng)至體積約為1,000 mm3時(shí)移植。

1.2.2 造模及分組 選擇生長(zhǎng)良好、瘤塊無(wú)破潰的荷瘤小鼠，脫頸處死，無(wú)菌條件下剝離瘤塊，用生理鹽水洗去血漬，剪開(kāi)瘤塊，清除中心壞死組織，充分勻漿制備瘤細(xì)胞懸液，加生理鹽水稀釋細(xì)胞數(shù)至1×107個(gè)/mL。取0.2 mL/只（含細(xì)胞數(shù)2×106/只）。接種于小鼠右腋窩皮下，接種在30 min內(nèi)完成。接種后第2天，根據(jù)性別分層，按腫瘤體積大小隨機(jī)分為模型對(duì)照組、沙利度胺組、茶多酚組、茶多酚聯(lián)合沙利度胺組，共4組，每組8只，稱(chēng)體重標(biāo)號(hào)。

1.2.3 給藥劑量及方法 給藥劑量均采用人與動(dòng)物劑量換算法確定。①模型對(duì)照組，生理鹽水每天0.2 mL/10 g灌胃；②沙利度胺對(duì)照組，沙利度胺按38 mg/kg/d（成人常用治療量600 mg/70 kg/d換算）給藥，生理鹽水配制成濃度3.8 mg/mL，每天0.2 mL/10 g灌胃；③茶多酚組，茶多酚按337.5 mg/kg/d（成人治療量2,700 mg/70 kg/d換算）給藥，生理鹽水配置濃度為16.875 mg/mL，每天0.2 mL/10 g灌胃；④聯(lián)合給藥組，兩藥的給藥劑量與單用藥組相同，為保證給藥劑量與灌胃體積的一致性，茶多酚配制濃度為675.0 mg/mL；沙利度胺配制濃度為7.6 mg/mL，每天各0.1 mL/10 g，灌胃。分組當(dāng)天開(kāi)始給藥，每天1次，連續(xù)10天。

1.2.4 瘤重及腫瘤抑制率 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察小鼠一般情況，用藥結(jié)束后第2天處死小鼠，取瘤稱(chēng)重，并按如下公式計(jì)算腫瘤抑制率：抑制率（%）=[1-（治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重）]×100%。

1.2.5 免疫組化標(biāo)本制備 取瘤稱(chēng)重后，每組隨機(jī)選擇6只小鼠移植瘤，制備腫瘤組織標(biāo)本（約1 cm×1 cm×1 cm大?。?，用10%中性緩沖福爾馬林液在室溫或4oC條件下固定，在60oC以下環(huán)境內(nèi)經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋制成蠟塊。

1.2.6 免疫組化指標(biāo)檢測(cè) 組織切片常規(guī)脫蠟、水化后，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)NF-κB、COX-2、Survivin蛋白表達(dá)。其中，NF-κB p65采用抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)，抗體稀釋度為1:30；COX-2進(jìn)行酶修復(fù)，抗體稀釋度為1:40；Survivin采用微波修復(fù)，抗體稀釋度為1:30。結(jié)果判斷：NF-κB、COX-2、Survivin蛋白陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色或棕褐色顆粒，NF-κB、Survivin主要定位于胞核或胞漿，COX-2主要定位于胞漿。各組每個(gè)指標(biāo)選取6個(gè)腫瘤組織切片，每片選3個(gè)視野，用美國(guó)IMAGE-PRO 6.2圖像分析系統(tǒng)作圖像分析，測(cè)定光密度（integrated optical density, IOD）值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用單因素方差分析SNK檢驗(yàn)或Tamhane'sT2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘤重及腫瘤抑制率 沙利度胺組、茶多酚組、聯(lián)合用藥組的腫瘤重量均低于對(duì)照組，提示對(duì)腫瘤具有抑制作用。其中，茶多酚聯(lián)合沙利度胺組的腫瘤抑制率為44.32%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組抑瘤率與沙利度胺組、茶多酚組比較，無(wú)明顯差別（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 NF-κB、COX-2、Survivin表達(dá) 實(shí)驗(yàn)各組NF-κB、COX-2、Survivin表達(dá)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，NF-κB表達(dá)在茶多酚組及聯(lián)合用藥組有所降低，與模型對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組NF-κB表達(dá)降低明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且聯(lián)合用藥組NF-κB表達(dá)低于沙利度胺組（P＜0.05），與茶多酚組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。COX-2表達(dá)在各治療組均有所下降，與模型對(duì)照組相比，聯(lián)合用藥組表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；且聯(lián)合用藥組COX-2表達(dá)明顯低于沙利度胺組（P＜0.05）和茶多酚組（P＜0.01）。而Survivin表達(dá)在各治療組均較模型對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），其中茶多酚組下降最為明顯（P＜0.01）；茶多酚組Survivin表達(dá)較聯(lián)合用藥及沙利度胺組下降更為明顯（P＜0.01）。各實(shí)驗(yàn)組NF-κB、COX-2、Survivin表達(dá)見(jiàn)圖1，其中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)主要為胞核棕染，COX-2、Survivin陽(yáng)性表達(dá)主要為胞質(zhì)棕染。

表1 實(shí)驗(yàn)各組腫瘤重量及抑瘤率的比較（Mean±SD）Tab 1 Comparision of tumor weight and tumor inhibition rate in each group (Mean±SD)

表2 各實(shí)驗(yàn)組NF-κB、COX-2和Survivin表達(dá)的IOD值比較（Mean±SD）Tab 2 Comparision of IOD value of NF-κB, COX-2 and Survivin in each group (Mean±SD)

3 討論

隨著研究的不斷深入，抗新生血管藥物在非小細(xì)胞肺癌臨床治療中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。目前世界上處于研究和開(kāi)發(fā)中的腫瘤血管生成抑制候選物超過(guò)300種，其中有數(shù)十種進(jìn)入臨床研究階段。以貝伐珠單抗（Avastin）、重組人血管內(nèi)皮抑制素（Endostar）、沙利度胺（Thalidomide）等為代表的抑制肺癌新生血管藥物雖然顯示了一定的治療效果，卻存在如下問(wèn)題：首先，Endostar在體內(nèi)代謝快，并有發(fā)生心肌缺血的危險(xiǎn)性，對(duì)高齡合并有心腦血管疾病的患者應(yīng)權(quán)衡患者治療受益和弊端。Thalidomide副作用相對(duì)較多，除常見(jiàn)的嗜睡、疲倦、便秘等副作用外，也可見(jiàn)周?chē)窠?jīng)病、深靜脈血栓、中毒性表皮壞死溶解癥等較重副作用，嚴(yán)重影響其臨床應(yīng)用；其次，Avastin、Endostar合成及提取費(fèi)用昂貴，患者持續(xù)性用藥會(huì)明顯增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，限制了臨床推廣應(yīng)用；再者，腫瘤血管生成是多因素作用的結(jié)果，而這些藥物大都只針對(duì)腫瘤血管生成諸多環(huán)節(jié)中的單一途徑，臨床療效并不如實(shí)驗(yàn)結(jié)果那樣理想和切實(shí)可行。因此從天然植物或中草藥中尋找新型抗腫瘤血管生成藥物成為當(dāng)前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)和突破口。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組NF-κB、COX-2和Survivin表達(dá)水平比較（SP, ×400）Fig 1 Expressions of NF-κB, COX-2 and Survivin in all groups (SP, ×400)

茶葉具有很好的藥用價(jià)值，唐代即有“茶藥”一詞?！短票静荨芬仓赋?，茶葉能“清頭目，除煩渴，化痰，消食，利尿，解毒”。近些年臨床工作者將其“化痰與解毒”的功能拓展到應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療。現(xiàn)代研究表明，其抗腫瘤的主要成分是茶葉中生物活性成分茶多酚。茶多酚由30多種含酚基的物質(zhì)組成，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為4類(lèi)：兒茶素類(lèi)、黃酮及黃酮醇類(lèi)、花白素和花青素類(lèi)、酚酸類(lèi)，其中以?xún)翰杷睾孔罡?，占總量?0%-80%，主要由D,L-C、EC、EGC、EGCE、GCG、ECG等幾種單體組成。前期研究[1-4]表明，茶多酚可下調(diào)VEGF、bFGF表達(dá)、上調(diào)TIMP-2表達(dá)并降低腫瘤組織MVD，聯(lián)合化療可以提高NSCLC的療效，但是對(duì)其所經(jīng)過(guò)的信號(hào)通路、作用機(jī)制與靶點(diǎn)尚不明確。

NF-κB是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，因其能夠與B細(xì)胞免疫球蛋白的κ親鏈基因的增強(qiáng)子κ B序列（GGGACTTTCC）特異性結(jié)合而得名。在未受刺激時(shí)，NF-κB二聚體與抑制性蛋白IκB結(jié)合，形成NF-κB/IκB復(fù)合物，存在于胞質(zhì)中；外源性刺激通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活I(lǐng)κB激酶（IKK）上游的激酶而使IKK活化，活化的IKK再使其底物IκB磷酸化，并進(jìn)一步降解，NF-κB發(fā)生核異位，與靶基因的特異位點(diǎn)相結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。IKK/IκB/NF-κB途徑各成員的異常有可能影響NF-κB的組成性活化，使NF-κB呈高水平誘導(dǎo)性活化，這在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和血管生成過(guò)程中具有重要意義。COX-2是前列腺素（prostaglandins, PGs）合成過(guò)程中的重要限速酶，許多腫瘤組織COX-2表達(dá)水平很高，而在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)很低[8]。COX-2的啟動(dòng)子序列中含有NF-κB特異結(jié)合序列，該序列與NF-κB結(jié)合后可以促進(jìn)COX-2基因的轉(zhuǎn)錄；COX-2又可通過(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)參與腫瘤血管生成[9]。Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族的成員，其過(guò)度表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞異常增殖與惡性轉(zhuǎn)化。近年研究[10]發(fā)現(xiàn)Survivin在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，與腫瘤血管生成密切相關(guān)；并且在NSCLC中，COX-2表達(dá)與Survivin表達(dá)呈正相關(guān)，而反義COX-2衍生的癌細(xì)胞中Survivin水平明顯降低[11]。

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)肺癌新生血管生成具有一定抑制作用：與模型對(duì)照組相比，沙利度胺組、茶多酚組、茶多酚聯(lián)合沙利度胺組的肺癌移植瘤微血管密度（micro-vessel density, MVD）明顯降低（P＜0.01），聯(lián)合用藥組下降較單藥組更為明顯（P＜0.05）；并且VEGF表達(dá)在用藥各組較模型對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）。這初步證明，茶多酚具有抗肺癌新生血管生成的效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)在建立C57小鼠Lewis肺癌移植瘤的基礎(chǔ)上，采用免疫組化方法觀測(cè)NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)因子表達(dá)，進(jìn)而探討茶多酚抗肺癌新生血管生成的可能效應(yīng)機(jī)制及靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照藥物沙利度胺又稱(chēng)反應(yīng)停，是抑制新生血管生成的代表藥物，其治療機(jī)理與抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子bFGF和 VEGF的表達(dá)、抑制TNF-α的分泌、降低血管內(nèi)皮細(xì)胞整合素等相關(guān)[12]。本項(xiàng)研究結(jié)果表明，茶多酚聯(lián)合沙利度胺能夠明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其作用可能與抗腫瘤新生血管生成相關(guān)。而其抑制腫瘤新生血管的效應(yīng)機(jī)制，則可能與抑制NF-κB信號(hào)通路的異常激活、抑制NF-κB活化、降低COX-2表達(dá)并降低內(nèi)皮細(xì)胞Survivin表達(dá)相關(guān)。聯(lián)合應(yīng)用茶多酚與沙利度胺對(duì)NF-κB和COX-2表達(dá)的抑制作用優(yōu)于單獨(dú)用藥，二者具有協(xié)同作用。除NF-κB信號(hào)通路外，茶多酚抑制Survivin表達(dá)尚存在其它主要途徑，但未能提高茶多酚抗腫瘤效應(yīng)。通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)，茶多酚在腫瘤治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。腫瘤的發(fā)生是多步驟、多環(huán)節(jié)作用的結(jié)果，我們還將從不同層次探索茶多酚抗肺癌作用靶點(diǎn)，揭示茶多酚抗肺癌機(jī)制，為推廣應(yīng)用及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。