唐愈菲 朱翠明

邵陽(yáng)地區(qū)肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類耐藥株的研究

唐愈菲 朱翠明

目的 了解邵陽(yáng)市肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的情況。方法 收集2009～2011年邵陽(yáng)地區(qū)感染肺炎支原體的患者的Mp（Mycoplasma pneumonia）臨床株，藥敏實(shí)驗(yàn)初步篩選對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥株，并通過(guò)提取耐藥株DNA，PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序鑒定突變發(fā)生的情況。結(jié)果共收集134支臨床肺炎支原體株，篩選出的12支臨床耐藥株中有4株發(fā)生了突變（占8.2%）突變?yōu)椋篈2063G，此突變?cè)谄渌麌?guó)家的相關(guān)研究中也經(jīng)常發(fā)生。結(jié)論 長(zhǎng)期使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可引起Mp耐藥并引起基因突變的情況發(fā)生，對(duì)此應(yīng)該引起臨床在用藥方面的重視。

肺炎支原體；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥；

肺炎支原體是呼吸道傳播的病原體，在引起社區(qū)獲得肺炎的病原體中有10%～40%的為肺炎支原體。社區(qū)獲得性肺炎具有自限性，通常持續(xù)數(shù)周便自愈，但有時(shí)也可引起嚴(yán)重的肺炎。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素一直為支原體肺炎臨床常用藥物，但是自2000年以來(lái)，以日本為主的報(bào)道發(fā)現(xiàn)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的肺炎支原體株的數(shù)量在逐年上升。而研究發(fā)現(xiàn)耐藥株引起的肺炎通常較敏感株治療困難。

1 資料和方法

1.1 一般資料 共陸續(xù)收集2009～2011年期間邵陽(yáng)地區(qū)3150株上呼吸道感染的臨床株，使用支原體快速診斷試劑盒發(fā)現(xiàn)其中有134株為肺炎支原體感染。其中55～75歲的患者有56株占41.79%。0～4歲47株占35.07%。每發(fā)現(xiàn)支原體感染的臨床株暫且置于-70℃保存，待使用時(shí)從冰箱取出進(jìn)行復(fù)蘇傳代。

1.2 M p快速診斷試劑盒及方法 試劑盒內(nèi)包括環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)管、BstDNA聚合酶；反應(yīng)管中含有反應(yīng)緩沖液、dNTP、硫酸鎂、 引物1：5′-ACCAA TGCCA TCAAC CCG-3′,引物2：5′-TACCG GCGTA ACGCA AAG-3′,引物3：5′-ATTTT CACCC GTGAG GGGGA GTTTT CGCTT AACCC CGTGA ACG-3′、引物4：5′-ACAGC GCTAA GGGCA TCACT GTTTT TCAAA GCCGC TTCGG TTC-3′、甜菜堿、氯化錳和鈣黃綠素。檢測(cè)肺炎支原體的方法包括待測(cè)樣品或細(xì)菌DNA的提取、肺炎支原體的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和顯色檢測(cè)。

1.3 藥敏實(shí)驗(yàn) 藥物選擇：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素代表藥物紅霉素(國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)目錄貨號(hào)：130351-200716)。藥敏實(shí)驗(yàn)中

藥敏孔的設(shè)置：各孔98μL培養(yǎng)基，2μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，藥敏濃度0.128μg/m L。M p若生長(zhǎng)，培養(yǎng)5～7d培養(yǎng)基由紅開(kāi)始變黃；若不生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色。同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照中不加藥物，陰性對(duì)照中不加藥物不加菌液。

1.4 M p耐藥株DNA提取 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根公司）提取高純度、高完整度的DNA產(chǎn)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下：⑴取M p陽(yáng)性菌液1～5m L，10000rpm離心1m in，盡量吸凈上清;⑵向菌體沉淀中加入200μL緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮;⑶向管中加入20μL蛋白酶K，混勻;⑷加入220μL緩沖液GB，振蕩15s，70℃水浴10m in，容易應(yīng)變清亮;⑸加入220μL無(wú)水乙醇，充分振蕩15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀;⑹將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)帶有吸附柱CB3的收集管中，12000rpm離心1m in，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中;⑺向吸附柱中加入500μL緩沖液GD（使用前加無(wú)水乙醇），12000rpm離心1m in，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中;⑻向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm離心1m in，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中;⑼重復(fù)第8步;⑽將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2m in，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干吸附柱材料中殘余的漂洗液;⑾將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200μL洗脫液TE，室溫放置2～5m in，12000rpm離心3m in，將溶液收集到離心管中。

1.5 PCR及跑膠鑒定 引物設(shè)計(jì)：L2F：5′-GTGaGtt ctccccGacc-3′，L2R：5′-ACTTTTGTACACCTCCTTGA-3′，L 22F：5′-CCCTGGTTTAA TTGCTA A-3′，L 22F：5′-TAATGTTGCTGGTGCTTT-3’。選擇原因：Mp常發(fā)生耐藥突變的兩個(gè)DNA片段。

PCR反應(yīng)體系：2×PCR M ix 12.5μL，上游引物下游引物各1μL，ddH 2O 8.5μL，DNA模板2μL，總體系為25μL。

將上述組分依次加入0.2m LEP管中，混勻點(diǎn)離后滴加1滴石蠟油，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物做測(cè)序鑒定有無(wú)發(fā)生基因突變。

2 結(jié)果

2.1 肺炎支原體株體外篩選及藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)M p快速診斷試劑盒，筆者發(fā)現(xiàn)在3150株上呼吸道感染患者的咽試子中，M p感染有134株（占4.2%）。

藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在134株M p中，紅霉素濃度為0.128μg/m L時(shí)，第5d開(kāi)始有生長(zhǎng)跡象的株數(shù)為3株，第7d有5株，至第12d共有4株存活，即表示134株中有12株發(fā)生了耐藥。耐藥率為8.96%。藥敏結(jié)果如表1。

表1 臨床耐藥實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性株編號(hào)，M IC值及生長(zhǎng)時(shí)間

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 PCR產(chǎn)物送到英韋創(chuàng)津公司測(cè)序，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)有4株發(fā)生了耐藥突變，突變點(diǎn)均為A 2063G。發(fā)生突變的菌株為1、16、19、22，發(fā)生突變的概率為33.33%（如圖1）。

圖1 突變位點(diǎn)示意圖

3 討論

Mp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥報(bào)道已經(jīng)越來(lái)越多，來(lái)自亞洲的報(bào)道占一半以上，感染M p的患者通常為兒童和老年人及其它體質(zhì)差的人群，患者免疫力弱，疾病持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，臨床用藥時(shí)間也增加，這樣以來(lái)容易引起Mp的耐藥。根據(jù)筆者做的耐藥篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者追溯到病例，發(fā)現(xiàn)12支耐藥株的病例均為兒童和老年人。也恰恰證實(shí)了，需要長(zhǎng)期治療的患者對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)生耐藥的可能性較高。

本研究的突變點(diǎn)為A 2063G，根據(jù)亞洲和歐洲的報(bào)道發(fā)現(xiàn)A 2063G的突變是主要的突變形式，且此突變模式有成為主導(dǎo)模式的趨勢(shì)[1]。由于有體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)A 2063G/A 2064G突變可以通過(guò)亞抑菌濃度傳代誘導(dǎo)發(fā)生[2]，以筆者推測(cè)這樣的趨勢(shì)可能與臨床大量使用抗生素有關(guān)。丹麥有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Mg（生殖支原體）也發(fā)生了同樣的耐藥突變[3]。長(zhǎng)期使用抗生素誘導(dǎo)與臨床長(zhǎng)期使用抗生素治療可能起著相同作用，即都能引起耐藥突變的發(fā)生。臨床上在發(fā)生耐藥時(shí)應(yīng)該如何進(jìn)行持續(xù)治療呢？在日本耐藥高發(fā)的地區(qū)，臨床已經(jīng)開(kāi)始采取交替使用不同類型的抗生素來(lái)治療疾病，且效果較好[4]。我國(guó)有一個(gè)小型試驗(yàn)，5例M p感染的患者對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素發(fā)生了耐藥，而用環(huán)丙沙星和糖皮質(zhì)激素治療卻得以治愈[5]。香港有報(bào)道顯示一例尿道感染支原體的患兒對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類嚴(yán)重耐藥，而改為強(qiáng)力霉素治療后，也得以治愈[5]。在亞洲，臨床以喹諾酮類和四環(huán)素類藥物作為對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的M p感染的患者的替換抗生素。因此本研究對(duì)邵陽(yáng)地區(qū)肺炎支原體肺炎在治療上抗生素使用方面的指導(dǎo)有著重要意義。

在此特別感謝邵陽(yáng)中心醫(yī)院為本實(shí)驗(yàn)提供的臨床菌株，感謝南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的老師和同學(xué)給予的支持。

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O b jective To get a better understanding on Macrolide-Resistant M ycoplasma pneumoniae in the Shaoyang City.Methods We collected 134 Clinical strains of patients had pneumonia that caused by M p between 2009～2011 in Shaoyang central hospital.12 Macrolide-resistant strains were detected from Susceptibility test for prelim inary screening of macrolide resistant strains.We extracted DNA from resistant strains and performed PCR and gene sequencing to detect the resistance mutant pattern.Results 4 mutant strains were found among 12 M p clinical Macrolideresistant strains.Conclusion Mp Macrolide-resistant mutant strains have been emerged in Shaoyang.A resonable treatment in Pnemonia shoud be leaded in clinic.

M ycoplasma penumonia;Macrolide-Resistant

book=25,ebook=116

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.016

國(guó)家自然科學(xué)基金（81072418/H1005）資助；湖南省教育廳青年基金（09B088）資助藥物濃度耐藥界定值以0.128μg/m L為準(zhǔn)，此濃度若M p生長(zhǎng)為耐藥株，若不生長(zhǎng)則為敏感株。

421001 湖南省衡陽(yáng)市南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原研究所 （唐愈菲朱翠明） 422000 邵陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校（唐愈菲）

朱翠明 E-mail:cuiming_zhu@yahoo.com.cn