史曉艷 陳駿 車團結(jié) 白德成 何祥一

（1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)院 修復(fù)科；2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)院 細胞與分子生物學(xué)實驗室；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，蘭州 730000）

口腔黏膜癌是常見的口腔惡性腫瘤，占男性全身癌的8%，女性全身癌的4%，其中舌癌是最常見的口腔癌[1]。傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放射及化學(xué)療法尚存在許多不足之處，而應(yīng)用微生物法預(yù)防和治療腫瘤是口腔醫(yī)學(xué)的研究熱點之一。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus）屬于乳酸桿菌屬[2]，是口腔中的正常菌群之一，在唾液中可以分離到。引起舌癌的致病因素非常多。研究[3]證實：舌癌患者口腔微生態(tài)平衡失調(diào)，可能導(dǎo)致舌癌的發(fā)生。研究[4-5]表明：L.acidophilus在抗變異原性、防癌抗癌和增強機體免疫力方面均發(fā)揮了重要作用。

本研究通過體外培養(yǎng)人舌癌細胞株Tca8113，研究L.acidophilus對Tca8113增殖的影響，并從誘導(dǎo)癌細胞凋亡及細胞內(nèi)自由基、Ca2+含量角度，初步探討其抗癌機制，為應(yīng)用L.acidophilus輔助治療口腔癌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

L.acidophilus ATCC 4356由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院惠贈；人舌癌細胞株Tca8113購自中國科學(xué)院上海藥物研究所；磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）（Sigma公司，美國）；Fluo-3/AM、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酯（2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，D-399）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）（Molecular probes公司，美國）；分析純二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京金亞奧國際貿(mào)易有限公司；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品。TCS SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）（Leica公司，德國）；酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測儀（酶標儀）、JY92-Ⅱ型超聲細胞粉碎機（上海分析儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物的制備 L.acidophilus在37℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h，3 600 r·min-1離心15 min，用0.22 μm濾膜過濾2次以除菌，得上清液。收集菌體，于65℃水浴熱滅活30min，光鏡和電鏡下觀察，要求細菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常；再經(jīng)Rogasa選擇性培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)至1周無細菌生長，PBS洗滌3次后調(diào)整菌密度至1×109CFU·mL-1，即為L.acidophilus滅活菌液[6]。未經(jīng)熱滅活處理的L.acidophilus菌液調(diào)整密度至1×109CFU·mL-1，經(jīng)超聲冰浴破碎，10 000 r·min-1離心10 min后所得上清液即為無細胞提取物[7]。

1.2.2 實驗分組 原液組：L.acidophilus上清液組、滅活菌液組和無細胞提取物組；倍比稀釋組：RPMI 1640細胞培養(yǎng)液4倍、16倍倍比稀釋原液組。本文的原液組與倍比稀釋組分別用1×、4×、16×表示，并設(shè)3個平行組。加入等量的完全培養(yǎng)液（含10%新生小牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液）為對照組。

1.2.3 Tca8113細胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)Tca8113細胞。

1.2.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察及細胞計數(shù) 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至每毫升5×104個，接種于6孔板，每孔2 mL。24 h細胞完全貼壁進入對數(shù)生長期后，加入L.acidophilus上清液組、滅活菌液組、無細胞提取物組，每個實驗組再按不同的倍比稀釋度設(shè)3個亞組（1×、4×、16×），每個亞組設(shè)3個復(fù)孔，每孔200 μL。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后取出，胰酶消化后進行細胞計數(shù)。

1.2.5 SRB法測定Tca8113細胞抑制率 將處于對數(shù)生長期的Tca8113細胞以每毫升5×104個的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL。實驗分兩組：1）將不同稀釋度的L.acidophilus上清液組、滅活菌液組、無細胞提取物組（倍比稀釋度：1×、4×、16×）加入細胞中，每個稀釋度設(shè)4個復(fù)孔，每孔20 μL，并設(shè)對照組，37℃培養(yǎng)48 h；2）將未稀釋的L.acidophilus上清液、滅活菌液和無細胞提取物組加入細胞中，每組設(shè)4個復(fù)孔，每孔20 μL，并設(shè)對照組，37℃分別培養(yǎng)24、48、72 h。培養(yǎng)完成后用三氯醋酸固定細胞1 h，去離子水洗5遍，晾干，每孔加入100 μL SRB液，室溫放置10 min，再用1%醋酸液洗5遍，晾干，每孔加入150 μL非緩沖Tris堿液（pH=10.5），于酶標儀上檢測515 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。細胞抑制率=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。

1.2.6 上清液、滅活菌液、無細胞提取物對Tca8113細胞周期的影響 將Tca8113細胞置于10 mL完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，細胞貼壁進入對數(shù)生長期后，加入1 mL未經(jīng)稀釋的上清液、滅活菌液和無細胞提取物，另設(shè)對照組，每組設(shè)3個平行組，48 h后用胰酶消化收集的細胞，采用流式細胞儀檢測細胞周期變化，分析G0及G1（G0/G1）期、S期、G2及M（G2/M）期細胞百分數(shù)。細胞增殖指數(shù)（cell proliferation index，CPI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

1.2.7 Tca8113細胞內(nèi)自由基的檢測 將處于對數(shù)生長期的Tca8113細胞以每毫升5×104個接種于CLSM專用培養(yǎng)板，每孔400 μL，待細胞貼壁后加入1.6 mL完全培養(yǎng)液，將未經(jīng)稀釋的上清液、滅活菌液和無細胞提取物加入細胞中，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔200 μL，并設(shè)對照組，37℃培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液加入新鮮的完全培養(yǎng)液50 μL于培養(yǎng)板中，加入10 μg·mL-1氧自由基特異性熒光探針D-399 50 μL，37℃避光負載45 min，PBS液洗3次，CLSM檢測細胞內(nèi)的自由基，激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光波長520 nm，以熒光強度表示自由基的量。

1.2.8 Tca8113細胞內(nèi)游離Ca2+檢測 細胞培養(yǎng)和實驗分組同1.2.7，37℃培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液加入新鮮完全培養(yǎng)液50 μL于培養(yǎng)板中，加入10 μmol·mL-1的Ca2+特異性熒光探針Fluo-3/AM 50 μL，37℃避光負載45 min，PBS液洗3次。CLSM檢測細胞內(nèi)游離Ca2+，激發(fā)光波長480 nm，發(fā)射光波長530 nm，以熒光強度表示細胞內(nèi)Ca2+含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量數(shù)據(jù)用±s描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)變化

倒置顯微鏡下觀察Tca8113細胞形態(tài)的變化見圖1。經(jīng)不同稀釋度的L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用后，原液組對Tca8113細胞的影響最大，48h后，Tca8113細胞的形態(tài)改變最為明顯，到72 h，上清液組大部分細胞處于死亡狀態(tài)，細胞漂浮。因此，筆者選擇48 h原液組進行細胞形態(tài)學(xué)的觀察記錄。觀察發(fā)現(xiàn)：48h后，細胞由菱形、多角形、鋪路石狀變?yōu)榧氶L形。與滅活菌液組（圖1c）、無細胞提取物組（圖1d）相比，上清液組（圖1b）的細胞數(shù)目最少。

2.2 細胞計數(shù)及L.acidophilus對Tca8113細胞增殖的影響

當(dāng)作用時間同為48 h時，經(jīng)細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)：倍比稀釋（1×、4×、16×）的上清液、滅活菌液、無細胞提取物均可抑制Tca8113細胞的增殖；未經(jīng)稀釋（1×）的上清液、滅活菌液、無細胞提取物的抑制力最強，隨著稀釋度的增加，抑制力減弱（圖2）。培養(yǎng)不同時間后，經(jīng)細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)：L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞24、48、72 h后，均可抑制細胞增殖，其中上清液的抑制力最強，時間越長抑制力越明顯（圖3）。

L.acidophilus各組作用時間同為48 h時，SRB法檢測Tca8113細胞增殖率的結(jié)果見表1：與細胞計數(shù)一致，未經(jīng)稀釋（1×）的上清液、滅活菌液、無細胞提取物對Tca8113細胞的抑制力最強，隨著稀釋度的增加，抑制力減弱，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。L.acidophilus上清液、滅活菌液和無細胞提取物分別作用24、48、72 h后，SRB法檢測Tca8113細胞增殖率的結(jié)果見表2：與細胞計數(shù)一致，上清液組在72 h時抑制力最強，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表 1 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞48 h后對細胞增殖的影響Tab 1 The effect of L.acidophilus supernatant,inactivated bacilli and cell free extracts on cell proliferation of Tca8113 after 48 h ±s

表 1 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞48 h后對細胞增殖的影響Tab 1 The effect of L.acidophilus supernatant,inactivated bacilli and cell free extracts on cell proliferation of Tca8113 after 48 h ±s

注：與對照組相比，*P＜0.01。

OD值抑制率/%1× 4× 16× 1× 4× 16×對照組 1.71±0.05 1.71±0.05 1.71±0.05 0 0 0上清液組 0.18±0.06* 0.47±0.06* 0.89±0.11* 89.54±3.68 72.80±3.40 48.15±0.64滅活菌液組 0.43±0.01* 0.70±0.03* 1.11±0.01* 74.69±0.76 59.41±1.51 35.54±0.37無細胞提取物組 0.86±0.06* 1.11±0.01* 1.48±0.13* 49.67±3.30 35.05±1.52 13.72±0.78組別

表 2 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞24、48、72 h后對細胞增殖率的影響Tab 2 The effect of L.acidophilus supernatant,inactivated bacilli and cell free extracts on cell proliferation of Tca8113 after 24,48,72 h ±s

表 2 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞24、48、72 h后對細胞增殖率的影響Tab 2 The effect of L.acidophilus supernatant,inactivated bacilli and cell free extracts on cell proliferation of Tca8113 after 24,48,72 h ±s

注：與對照組相比，*P＜0.01。

OD值抑制率/%組別 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h對照組 0.88±0.04 1.71±0.05 2.07±0.07 0 0 0上清液組 0.48±0.02* 0.18±0.06* 0.05±0.01* 45.50±4.50 89.54±3.68 97.45±0.42滅活菌液組 0.52±0.05* 0.43±0.01* 0.19±0.01* 41.25±3.47 74.69±0.76 90.88±0.35無細胞提取物組 0.64±0.07* 0.86±0.06* 0.62±0.04* 26.98±0.92 49.67±3.30 69.88±1.52

2.3 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物對Tca8113細胞周期的影響

L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞48 h后，與對照組相比，各實驗組G0/G1期細胞所占比例均升高，S期、G2/M期所占比例均明顯降低，反映細胞增殖活力的指數(shù)CPI均降低（表3）；其中上清液組抑制力最明顯，與對照組相比其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表 3 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物對Tca8113細胞周期的影響Tab 3 Effect of L.acidophilus supernatant,inactivated bacilli and cell free extracts on cell cycle distribution of Tca8113 %,±s

表 3 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物對Tca8113細胞周期的影響Tab 3 Effect of L.acidophilus supernatant,inactivated bacilli and cell free extracts on cell cycle distribution of Tca8113 %,±s

注：與對照組相比，△P＜0.05，*P＜0.01。

細胞周期G0/G1期 S期 G2/M期 CPI對照組 40.60±1.64 55.91±2.18 3.49±1.87 59.40±1.64上清液組 66.58±3.48* 33.41±3.48* 0* 33.41±3.48*滅活菌液組 57.61±2.29* 42.39±2.29* 0* 42.39±2.29*無細胞提取物組 50.29±1.75* 49.71±1.75△ 0* 49.71±1.75*組別

2.4 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物對Tca8113細胞內(nèi)自由基和Ca2+含量的影響

L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞48 h后，與對照組相比，各實驗組自由基和Ca2+含量均升高（圖4、5和表4），其中上清液組Tca8113細胞內(nèi)自由基和Ca2+含量升高最明顯，與對照組相比其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表 4 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞48 h后細胞內(nèi)的自由基和Ca2+含量Tab 4 The effect by supernatant,inactivated bacilli and cell free extracts of L.acidophilus on content of free radicals and Ca2+in Tca8113 after 48 h ±s

表 4 L.acidophilus上清液、滅活菌液、無細胞提取物作用Tca8113細胞48 h后細胞內(nèi)的自由基和Ca2+含量Tab 4 The effect by supernatant,inactivated bacilli and cell free extracts of L.acidophilus on content of free radicals and Ca2+in Tca8113 after 48 h ±s

注：與對照組相比，*P＜0.01。

組別 自由基含量 Ca2+含量對照組 94.42±3.38 20.85±2.89上清液組 245.67±3.02* 79.52±4.58*滅活菌液組 197.26±4.36* 52.62±2.24*無細胞提取物組 155.82±2.28* 38.79±3.58*

3 討論

研究[8]證實：乳酸桿菌產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)（細胞壁肽聚糖）、有機酸（乳酸、乙酸、丙酮酸等）、細菌素、過氧化氫等多種代謝產(chǎn)物均有很好的抗腫瘤作用。乳酸桿菌產(chǎn)生的過氧化氫可產(chǎn)生羥自由基，引起DNA單鏈斷裂，破壞腫瘤細胞DNA的合成和表達，引起細胞凋亡或壞死。劉軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)：乳酸桿菌代謝產(chǎn)物能夠明顯抑制與癌癥密切相關(guān)的白色假絲酵母菌對上皮細胞的黏附。彭繼承等[10]研究發(fā)現(xiàn)：乳酸桿菌粗制代謝產(chǎn)物對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有防治作用，但其作用機制尚不十分明確。本研究結(jié)果顯示：L.acidophilus上清液組對人舌癌細胞增殖能力的抑制作用最強，其抑制作用具有密度依賴性和時間依賴性，上清液細菌密度越高、作用時間越長，Tca8113細胞的增殖能力越弱；同時，細胞內(nèi)自由基及Ca2+含量均明顯升高。這可能與L.acidophilus產(chǎn)生的過氧化氫導(dǎo)致自由基生成過多，而自由基含量升高可以導(dǎo)致細胞Ca2+內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca2+超載，引起細胞凋亡或死亡有關(guān)。

在體外研究[11-13]中發(fā)現(xiàn)：經(jīng)加熱滅活處理的乳酸桿菌對腸黏膜細胞具有較強的黏附性，并可發(fā)揮黏附拮抗作用，L.acidophilus等多種乳酸桿菌可阻止幽門螺桿菌在哺乳類動物上皮細胞的黏附。有研究[14]發(fā)現(xiàn)：滅活乳酸桿菌在短時間的黏附一般不會導(dǎo)致細胞活力下降，細胞活力短時間的維持有利于乳酸桿菌與細胞的黏附，隨著黏附的乳酸桿菌增多，乳酸桿菌表面的糖類、磷脂類等物質(zhì)以及在溶菌酶[15]作用下乳酸桿菌細胞壁破裂內(nèi)容物逸出后暴露的部分細菌DNA中的CpG基序、AT核苷酸，可能更好地激發(fā)免疫系統(tǒng)以發(fā)揮抗腫瘤作用，導(dǎo)致人舌癌細胞的凋亡與死亡。

研究[13]證實：乳酸桿菌表面的肽聚糖、脂磷壁酸以及源于細菌DNA中的CpG基序可直接誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化和凋亡，其中CpG基序起著更為重要的作用。細菌核酸中含有CpG基序的部分可通過與人體細胞表面特異性受體——Toll樣受體家族中的Toll樣受體9（Toll like receptor 9，TLR9）相結(jié)合，激活機體的免疫反應(yīng)[16]。乳酸桿菌基因組AT核苷酸也可以通過與TLR9結(jié)合來增強Th1型免疫反應(yīng)，上調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)水平[17]。本實驗將L.acidophilus熱滅活菌液與Tca8113細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)滅活菌液也有抑制人舌癌細胞增殖的能力，可導(dǎo)致細胞內(nèi)自由基及Ca2+含量升高，這可能與乳酸桿菌表面的糖類、磷脂類物質(zhì)以及細菌DNA中的CpG基序、AT核苷酸激發(fā)免疫抗腫瘤作用從而導(dǎo)致舌癌細胞的凋亡與死亡有關(guān)。

本實驗發(fā)現(xiàn)：無細胞提取物組對Tca8113細胞的抑制作用高于對照組，但與滅活菌液組相比其抑制力較弱，可能是由于滅活菌液組可發(fā)揮較強的黏附作用，黏附于舌癌細胞表面，通過L.acidophilus表面的肽聚糖、脂磷壁酸以及源于細菌DNA中的CpG基序直接誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化和凋亡，而無細胞提取物組不能發(fā)揮黏附作用，抑制能力相對較弱。

關(guān)于乳酸桿菌的生物安全性問題，有研究[18-19]發(fā)現(xiàn)：乳酸桿菌HO-69引發(fā)齲病與促進齲病發(fā)展的概率很低，具有廣譜抑菌活性，可抑制與口腔癌密切相關(guān)的白色假絲酵母菌的黏附，是潛在的口腔益生菌。但有關(guān)乳酸桿菌致齲作用的研究頗有爭議。有學(xué)者[20]認為乳酸桿菌數(shù)量增多是齲病進展的結(jié)果而不是致齲的原因；也有學(xué)者[21-22]認為乳酸桿菌可以抑制某些齲病病原菌的生長，從而可能有防治齲病的作用。復(fù)方L.acidophilus片作為腸道菌群調(diào)整藥已應(yīng)用于臨床，但L.acidophilus對人口腔癌治療的相關(guān)研究甚少，其安全性有待于進一步探索。

研究發(fā)現(xiàn)L.acidophilus對人舌癌細胞的增殖有抑制作用。但是體外培養(yǎng)模型與臨床實際情況還有一定差距，今后尚需對抑癌基因或主要信號傳導(dǎo)通路及信號分子作深入研究，從分子水平揭示乳酸桿菌抑制腫瘤細胞增殖的作用機制，并建立與臨床密切相關(guān)的模型，為口腔癌治療提供新途徑。

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