郭勝勝 章根訓(xùn) 王楊洋 馬堅(jiān) 任紅旺 趙桂治 李亞娣 石冰 黃永清，

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 研究生部；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 口腔頜面外科，銀川 750004；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 唇腭裂外科，成都 610041）

非綜合征型唇腭裂（non-syndromic oral clefting，NSOC）是最常見(jiàn)的先天性顱面畸形之一，世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為1‰～2‰。不同人群NSOC的發(fā)病率存在差異[1]，我國(guó)新生兒的發(fā)病率約為1.82‰[2]。NSOC病因較為復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為該疾病是由遺傳因素、環(huán)境因素及二者的交互作用所致[3-4]。NSOC具有遺傳異質(zhì)性，對(duì)不同人群研究所得結(jié)果不盡相同。

本課題組研究[5-7]并證實(shí)了干擾素調(diào)節(jié)因子6（interferon regulatory factor 6，IRF6）基因和同源異形盒基因MSX1與NSOC具有相關(guān)性。小泛素化修飾基因-1（small ubiquitin-related modifier-1，SUMO-1）編碼的小泛素化修飾蛋白是一種修飾蛋白，對(duì)T-box transcription factor 22（TBX22）[8]及MSX1[9]基因具有調(diào)控作用。因此，有必要研究SUMO-1基因與NSOC是否具有相關(guān)性。為此本研究選擇SUMO-1基因rs6709162、rs7599810和rs7580433位點(diǎn)，研究和探討寧夏人群SUMO-1基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與NSOC的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究收集2006年1月—2009年12月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科的NSOC患者核心家系（家族3代以上為寧夏人）為研究對(duì)象，共收集唇裂患者55例、腭裂58例、唇腭裂95例，患者父親189例、患者母親176例，完整核心家系（患者及其父母）172個(gè)。所有病例均排除了其他先天性畸形及綜合征型唇腭裂。經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)，簽訂書(shū)面知情同意書(shū)后，采集研究對(duì)象的外周全血5 mL。此外，收集同期、相同地區(qū)出生的正常對(duì)照組新生兒284例，抽取臍帶血5 mL。

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）檢測(cè)

將收集到的5 mL全血，經(jīng)檸檬酸葡萄糖溶液抗凝，提取基因組DNA，然后行PCR擴(kuò)增、酶切及基因分型。引物、內(nèi)切酶和酶切后的產(chǎn)物片段詳見(jiàn)表1。為驗(yàn)證基因分型的正確性，每批試驗(yàn)均設(shè)立陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，同時(shí)隨機(jī)挑選10%的樣本直接測(cè)序。

表 1 SUMO-1多態(tài)位點(diǎn)及引物、內(nèi)切酶情況Tab 1 Primers and incision enzyme information in SUMO-1 polymorphism sites

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)患者雙親和對(duì)照組基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg（HW）平衡檢驗(yàn)。利用SPSS 11.5軟件對(duì)患者及其父母與對(duì)照組基因型和等位基因進(jìn)行分析，采用傳遞不平衡檢驗(yàn)（transmission disequilibrium test，TDT）及以家系為基礎(chǔ)的相關(guān)性檢驗(yàn)（family based association test，F(xiàn)BAT），分析SUMO-1的rs6709162、rs7599810和rs7580433多態(tài)位點(diǎn)與NSOC的相關(guān)性，并進(jìn)行3個(gè)位點(diǎn)間組合的單倍型分析。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果

對(duì)rs6709162、rs7599810和rs7580433多態(tài)位點(diǎn)的酶切電泳分型結(jié)果如圖1～3所示。隨機(jī)挑選10%的樣本直接測(cè)序，酶切后分型的結(jié)果與測(cè)序的結(jié)果完全一致。

2.2 HW平衡檢驗(yàn)

患者及其父母和對(duì)照組基因型的頻率分布均符合HW平衡，其結(jié)果詳見(jiàn)表2～4。

表 2 SUMO-1基因rs6709162位點(diǎn)HW平衡檢驗(yàn)結(jié)果以及基因型、等位基因的分布和比較Tab 2 Tests of HW equilibrium,genotypes and alleles distribution and comparisons of the SUMO-1 rs6709162

表 3 SUMO-1基因rs7599810位點(diǎn)HW平衡檢驗(yàn)結(jié)果以及基因型、等位基因的分布和比較Tab 3 Tests of HW equilibrium,genotypes and alleles distribution and comparisons of the SUMO-1 rs7599810

2.3 病例對(duì)照分析

病例組與對(duì)照組rs6709162、rs7599810和rs758-0433基因型及等位基因的比較見(jiàn)表2～4。其中，rs75-99810位點(diǎn)的TT基因型頻率在唇裂組、腭裂組及總病例組（唇裂、腭裂、唇腭裂3組之和）與對(duì)照組比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01，P=0.01，P=0.01）。

表 4 SUMO-1基因rs7580433位點(diǎn)HW平衡檢驗(yàn)結(jié)果以及基因型、等位基因的分布和比較Tab 4 Tests of HW equilibrium,genotypes and alleles distribution and comparisons of the SUMO-1 rs7580433

2.4 TDT分析

TDT分析結(jié)果見(jiàn)表5。rs6709162位點(diǎn)的C等位基因在腭裂和唇腭裂患者中存在過(guò)傳遞（P=0.00，P=0.01）；rs7599810位點(diǎn)的T等位基因在唇腭裂患者中存在過(guò)傳遞（P=0.00）；rs7580433位點(diǎn)的G等位基因在唇裂患者中存在過(guò)傳遞（P=0.05）。

表 5 TDT分析結(jié)果Tab 5 Results of TDT analysis

2.5 FBAT分析

FBAT參數(shù)設(shè)定為加性模型（model additive）、雙等位遺傳模型（mode bi-allelic）、基因型模型（model genotype），進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：SUMO-1基因的rs7599810位點(diǎn)的C、T等位基因分布的頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00，P=0.00），TT基因型的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。rs6709162和rs7580433位點(diǎn)在基因型分布和等位基因分布頻率上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

NSOC是一類(lèi)多基因遺傳病，具有顯著的遺傳異質(zhì)性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與NSOC相關(guān)的主要基因有IRF6、MSX1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3、TBX22等[8，10-13]。SUMO-1基因通過(guò)產(chǎn)生小泛素化修飾蛋白對(duì)其他基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后的產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控，對(duì)維持染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有一定的作用[14]。SUMO-1參與調(diào)節(jié)DNA的修復(fù)、調(diào)控離子通道，并參與細(xì)胞內(nèi)通路的調(diào)控[15]。MSX1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可被類(lèi)泛素化修飾，并對(duì)MSX1的功能進(jìn)行調(diào)控[9]。MSX1作為頜面部發(fā)育過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子貫穿于頜面部發(fā)育的全過(guò)程，并與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用[16]，在頜面部形成中發(fā)揮作用。同時(shí)，SUMO-1可與靶蛋白結(jié)合對(duì)Mus musculus stabilin（STAB）基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[17-18]。SUMO-1還可對(duì)TBX22基因進(jìn)行調(diào)控，而TBX22基因的突變可能引起唇腭裂的發(fā)生[8]。因此，SUMO-1基因的表達(dá)和唇腭裂的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系。SUMO-1基因的多態(tài)性可以引起單倍劑量不足，繼而影響唇腭裂的發(fā)生[19]。

本研究從HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了SUMO-1基因的3個(gè)位點(diǎn)：rs6709162、rs7599810和rs7580433。rs6709162和rs7599810位于SUMO-1基因第1內(nèi)含子中，rs7580433位于第2內(nèi)含子中。這3個(gè)SNP位點(diǎn)雖然不直接參與蛋白的表達(dá)，但可能參與調(diào)控SUMO-1基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，以及影響翻譯后SUMO-1蛋白的功能；還可能和其他基因共同作用，與唇腭裂疾病的發(fā)生具有相關(guān)性。患者父母親及對(duì)照組基因型的頻率分布均符合HW平衡定律，表明本研究選取的試驗(yàn)對(duì)象具有群體代表性。

本研究中對(duì)照組rs7599810位點(diǎn)的T等位基因頻率為60.4%，與HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中北京漢族人群T等位基因頻率的65.1%相比較稍低。病例對(duì)照分析發(fā)現(xiàn)：SUMO-1基因的rs7599810多態(tài)性在唇裂組、腭裂組以及總病例組與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.01，P=0.01，P=0.01）；TT基因型在唇裂組、腭裂組的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為2.03（95%CI：1.13～3.64）和1.80（95%CI：0.97～3.34），提示rs7599810位點(diǎn)TT基因型是唇裂、腭裂的危險(xiǎn)基因型。TDT分析顯示：rs7599810位點(diǎn)的T等位基因在唇腭裂組中存在過(guò)傳遞（P=0.00）。FBAT分析顯示：rs7599810位點(diǎn)C、T等位基因分布的頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00，P=0.00），TT基因型的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。上述分析說(shuō)明rs7599810位點(diǎn)T等位基因過(guò)傳遞和TT基因型與NSOC存在相關(guān)性。

本研究中對(duì)照組中rs6709162的T等位基因頻率為30.1%，與HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中北京漢族人群T等位基因頻率26.2%相比較稍高。病例對(duì)照分析發(fā)現(xiàn)：病例組各組與對(duì)照組比較，rs6709162位點(diǎn)在基因型分布和等位基因頻率分布上的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TDT分析顯示：rs6709162位點(diǎn)C等位基因在腭裂組和唇腭裂組中存在過(guò)傳遞（P=0.00，P=0.01），而在唇裂組則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TDT分析結(jié)果與病例對(duì)照研究所得結(jié)果不同，可能是由于病例對(duì)照研究中選取了全部的樣本而TDT分析中只選取了完整的3人核心家系，排除了群體遺傳背景的差異，這恰恰顯示了TDT分析的優(yōu)勢(shì)，因而更具有可靠性。因此，rs6709162位點(diǎn)C等位基因的過(guò)傳遞和NSOC的發(fā)生具有相關(guān)性。Jia等[20]的研究結(jié)果表明：rs6709162位點(diǎn)C等位基因無(wú)過(guò)傳遞（P=0.14），但是增加了患NSOC的風(fēng)險(xiǎn)。該結(jié)果與本研究結(jié)果有差異，可能跟分組方式、研究人群地域分布及民族差別有關(guān)。

本研究中對(duì)照組rs7580433位點(diǎn)的A等位基因頻率為6.9%，與HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中北京漢族人群A等位基因頻率7.8%基本一致。病例對(duì)照分析結(jié)果表明：病例組各組與對(duì)照組比較，rs7580433位點(diǎn)在基因型分布和等位基因頻率分布上的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。TDT分析顯示：rs7580433位點(diǎn)的G等位基因在唇裂組中存在過(guò)傳遞（P=0.05），說(shuō)明rs7580433位點(diǎn)G等位基因的過(guò)傳遞與NSOC存在相關(guān)性。

本研究證實(shí)SUMO-1基因rs6709162、rs7599810和rs7580433位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏人群NSOC的發(fā)病具有相關(guān)性。由于NSOC是由遺傳因素和環(huán)境因素及二者的交互作用所致，并且可能和多個(gè)基因存在相關(guān)性，而SUMO-1基因作為編碼小泛素化修飾蛋白的基因，可能和其他基因相互作用，在唇腭裂的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用。所以今后的研究需要考慮到其他可能的基因和環(huán)境因素以及它們的相互作用，綜合起來(lái)探討其對(duì)NSOC發(fā)病的影響。

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