朱恒梅，祝勝郎，陳結(jié)慧，葉 玲，蔣 瑩，李向陽

(深圳市第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 510082)

多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1介導(dǎo)高糖致大鼠腎臟系膜細(xì)胞tPA/PAI-1的紊亂

朱恒梅，祝勝郎*，陳結(jié)慧，葉 玲，蔣 瑩，李向陽

(深圳市第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 510082)

目的 探討多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1(PARP-1)在高糖(25 mmol/L)作用下大鼠腎臟系膜細(xì)胞tPA/PAI-1纖溶系統(tǒng)紊亂中的作用。方法(1)體外培養(yǎng)大鼠腎臟系膜細(xì)胞株(MCs 1097)，使用高糖(25 mmol/L)處理大鼠腎臟系膜細(xì)胞，部分實驗組中應(yīng)用PARP-1特異性抑制劑PJ34(3×10-6mol/L)進(jìn)行干預(yù)處理。(2)RT-PCR及Western blot檢測PARP-1的mRNA及蛋白表達(dá)。(3)高通量比色測定法檢測PARP-1的活性。(4)ELISA法測定細(xì)胞上清液tPA、PAI-1的分泌蛋白。結(jié)果(1)高糖顯著誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞PARP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，PJ-34可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的PARP-1 mRNA和蛋白的過度表達(dá)。同時，高糖顯著誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞PARP-1激活，PJ-34可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的PARP激活。(2)高糖輕度減少大鼠腎臟系膜細(xì)胞分泌型tPA的蛋白表達(dá)，顯著增加大鼠腎臟系膜細(xì)胞分泌型PAI-1的蛋白表達(dá)，導(dǎo)致tPA/PAI-1比值降低，PJ-34顯著預(yù)防高糖誘導(dǎo)的上述改變。結(jié)論高糖可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞內(nèi)PARP激活，PARP1表達(dá)增加，PJ-34預(yù)處理可以明顯降低高糖誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞內(nèi)PARP的激活以及下游tPA/PAI-1纖溶系統(tǒng)紊亂，提示高糖可能通過過度激活PARP來誘導(dǎo)tPA/PAI-1功能紊亂。

系膜細(xì)胞；PARP；高糖；tPA/PAI-1；纖溶系統(tǒng)

PARP是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，能選擇性識別并結(jié)合DNA缺口的DNA結(jié)合蛋白酶，具有保持染色體結(jié)構(gòu)完整、參與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的功能，在維持基因組穩(wěn)定和細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮作用[1-2]。高血糖介導(dǎo)的活性氧(ROS)可以激活多聚ADP核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]，提示其在糖尿病病程中可能發(fā)揮作用。組織型纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物-1(tPA/PAI-1)是主要的纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)，不僅能直接降解細(xì)胞外基質(zhì)，還能激活金屬蛋白酶間接降解基質(zhì)，處于各種調(diào)節(jié)酶系的上游，在糖尿病腎小球硬化中發(fā)揮重要作用。腎小球系膜細(xì)胞是糖尿病腎病(DN)損傷的中心環(huán)節(jié)，因此本實驗以大鼠腎臟系膜細(xì)胞作為研究對象，探討多聚二磷酸腺苷(ADP)核糖聚合酶-1(PARP-1)在高糖致tPA/PAI-1紊亂中的作用，以探討PARP在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 D-Glucose購自Sigma公司，PJ-34購自默克公司；細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640，胎牛血清購自Gibco公司；Trizol溶液購自美國Invitrogen公司；胰島素購自甘李藥物公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液、HRP標(biāo)記的兔抗大鼠Ⅱ抗購自Cell signaling公司，兔抗大鼠PARP-1一抗購自CHEMICON公司；tPA、PAI-1酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)有限公司；PARP/ Apoptosis檢測試劑盒購自trevigen公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，Taq DNA聚合酶購自Takaka公司。其余化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組大鼠腎臟系膜細(xì)胞株(MCs 1097，購自美國ATCC公司)培養(yǎng)于含有15%胎牛血清及0.6 U/ml胰島素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)至85%融合后，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，后換用新鮮無血清的DMEM低糖(5 mmol/L)培養(yǎng)基，分別加入藥物刺激干預(yù)：高糖刺激組中高糖濃度為25 mmol/L，刺激時間為24 h。PJ34干預(yù)組先給予3× 10-6mol/L PJ34孵育1h后，加入高糖刺激24 h。單純使用PJ34組作為對照。

1.2.2 細(xì)胞總蛋白提取 細(xì)胞用PBS清洗后加入細(xì)胞裂解液，冰上放置5 min。用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，收集至1.5 ml Eppendorf管中，放置于冰上。用超聲粉碎儀在冰上進(jìn)行超聲粉碎，500 W、1 s×15次，以剪切DNA，降低黏稠度。4℃，12 000 r/min離心10 min，留取上清。取10 μl上清測定濃度，余儲存于-80℃?zhèn)溆?。?xì)胞總蛋白提取物做Western blot分析高糖對于大鼠腎臟系膜細(xì)胞PARP-1表達(dá)的影響。

1.2.3 RT-PCR 大鼠腎臟系膜細(xì)胞總RNA的提取按照Trizol說明書操作。RT-PCR引物購自美國INVITROGEN公司上海分部。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及RT-PCR反應(yīng)：取1.0 μg的總RNA采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，以O(shè)ligo(dT)18為引物合成第一鏈cDNA(按試劑盒說明書進(jìn)行)；②PCR：采用Takaka公司試劑盒PCR反應(yīng)擴增。引物序列如表1。產(chǎn)物儲存于-20℃。取8 μl PCR產(chǎn)物在含有0.5 μg/ml溴化乙淀(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠中以85 V恒壓電泳30 min，紫外檢測儀上觀察，用凝膠圖像成像系統(tǒng)成像及進(jìn)行掃描定量分析DNA帶的含量，以所測得積分吸光度與內(nèi)參照β-Actin積分吸光度的比值代表半定量值。PARP-1及β-Actin引物及反應(yīng)條件見表1。

表1 PCR引物合成序列

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中tPA PAI-1的含量按照ELISA試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行。

1.2.5 PARP活性檢測 細(xì)胞PARP活性檢測按照PARP/Apoptosis檢測試劑盒(trevigen公司)說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)之間差異顯著性用多個樣本均數(shù)比較及兩兩用ANOVA方差分析檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PJ34抑制高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞PARP-1的過表達(dá) 應(yīng)用高糖刺激大鼠腎臟系膜細(xì)胞，高糖組系膜細(xì)胞PARP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)較較低糖對照組明顯增加，分別較低糖對照組增加72.3%和68.4%(P＜0.05)，PJ34組系膜細(xì)胞PARP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)分別減少為高糖組的31.8%和55.5%(P＜0.05，見圖1，圖2)。單純使用PJ-34不影響系膜細(xì)胞PARP-1的表達(dá)。同時，高糖顯著誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞PARP-1激活，高糖組為對照組活性的1.77倍(P＜0.05)，給予PJ-34預(yù)處理可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的PARP激活，活性降低為高糖刺激組的67.8% (P＜0.05，見圖3)。

2.2 PJ34 抑制高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞上清液tPA及PAI-1蛋白的過表達(dá) 應(yīng)用高糖刺激大鼠腎臟系膜細(xì)胞，高糖組系膜細(xì)胞分泌的tPA蛋白顯著下降，較低糖對照組下降30.0%(P＜0.05)，分泌的PAI-1蛋白明顯增加，較低糖對照組增加70.7%(P＜0.05)，tPA/PAI-1比值較低糖對照組減少41.0%(P＜0.05)。PJ34組系膜細(xì)胞分泌的tPA蛋白有所增加，較高糖組增加30.8%(P＜0.05)，分泌的PAI-1蛋白則較高糖組明顯下降，為高糖組的73.2%(P＜0.05)，tPA/PAI-1比值則較高糖組增加78.6%(P＜0.05，見圖4)。單純使用PJ-34不影響系膜細(xì)胞上清液tPA及PAI-1蛋白的表達(dá)。

圖1 高糖(25 mmol/L)誘導(dǎo)PARP-1 mRNA表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用

圖2 高糖(25 mmol/L)誘導(dǎo)PARP-1蛋白表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用

圖3 高糖(25 mmol/L)誘導(dǎo)PARP-1活性表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用

圖4 高糖(25 mmol/L)誘導(dǎo)tPA、PAI-1蛋白的過表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用

3 討論

DN是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是發(fā)達(dá)國家終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)的首要原因，我國近年來發(fā)病率也有不斷上升的趨勢[3]。糖尿病腎病早期的病理變化主要表現(xiàn)為：腎小球系膜基質(zhì)增寬及毛細(xì)血管基底膜增厚，后期出現(xiàn)腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。糖尿病腎病的發(fā)病過程中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積是其病理損害的關(guān)鍵。ECM的過度積聚可以導(dǎo)致腎小球系膜膜基質(zhì)增厚，腎小球肥大，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化。ECM的產(chǎn)生增加和(或)降解減少是ECM積聚的主要原因。ECM主要包括膠原(Collagen，COL)，層粘連蛋白(Laminin，LN)，纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)[4-5]。筆者未發(fā)表的數(shù)據(jù)再次證實了高糖顯著增加COLⅣ和FN表達(dá)。tPA/PAI-1是主要的纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)，PAI-1是tPA的天然抑制劑，糖尿病時，tPA/PAI-1功能紊亂，導(dǎo)致tPA表達(dá)減少，PAI-1表達(dá)增多，抑制了纖溶系統(tǒng)的功能，使纖溶酶酶原活化減少，纖維蛋白/纖維蛋白原降解減少，ECM降解受到抑制，在糖尿病ECM積聚中發(fā)揮重要作用[6]。在本研究中，我們同樣觀察到應(yīng)用高糖刺激大鼠腎臟系膜細(xì)胞，高糖組系膜細(xì)胞分泌的tPA蛋白有所下降，PAI-1蛋白明顯增加，tPA/PAI-1比值降低，再次證實糖尿病時tPA/PAI-1功能紊亂。

研究表明，高糖損傷的細(xì)胞類型都具有一致的特點，都有ROS的生成增多[7]。高血糖介導(dǎo)的ROS通過在過度激活PARP來抑制關(guān)鍵的糖酵解酶GAPDH，引起糖酵解的中間產(chǎn)物大量堆積，其中，增加的中間產(chǎn)物3-磷酸甘油醛激活了AGE途徑和PKC途徑[8]。另一種中間產(chǎn)物6-磷酸果糖使得己糖氨通路流量增加[9]。最終，GAPDH的抑制使得糖酵解的第一步代謝物—葡萄糖水平升高。高糖可增強羥基化途徑，降低醛糖還原酶活性，從而激活多元醇途徑[10]。而Suzuki等[11]證實高糖誘導(dǎo)PAI-1基因表達(dá)部分是通過PKC途徑；也有報道指出，高糖也能經(jīng)己糖氨通路及AGE途徑促進(jìn)PAI-1基因表達(dá)[12]。因此，我們可推斷高糖通過過度激活PARP來誘導(dǎo)tPA/PAI-1功能紊亂。

PARP是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶。主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，少量存在于細(xì)胞漿內(nèi)。它是能選擇性識別并結(jié)合DNA缺口的DNA結(jié)合蛋白酶，主要通過修復(fù)DNA單鏈及雙鏈斷裂在維持基因組的完整性方面發(fā)揮作用[1]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)抑制PARP可以顯著改善高糖所致腹膜間皮細(xì)胞的PAI-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)分化及纖維化[13]。我們還發(fā)現(xiàn)下調(diào)PARP-1活性及表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)AngII誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞PAI-1的表達(dá)并抑制細(xì)胞外基質(zhì)積聚[14]。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖刺激可以引起大鼠系膜細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)PARP激活，PARP-1表達(dá)升高以及分泌的tPA蛋白有所下降，PAI-1蛋白明顯增加，tPA/PAI-1比值降低，提示tPA/PAI-1功能紊亂。我們還首次發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PARP抑制劑PJ34干預(yù)后大鼠系膜細(xì)胞PARP-1活性及表達(dá)降低，明顯改善了高糖誘導(dǎo)的FtPA/PAI-1功能紊亂。首次證實了高糖可能通過過度激活PARP來誘導(dǎo)tPA/PAI-1功能紊亂。因此，研究和開發(fā)PARP抑制劑，將為臨床治療氧化應(yīng)激相關(guān)性疾病提供新策略和新方法,為糖尿病腎病的治療提供一個新的思路。

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Effect of Poly(ADP-ribose)Polymerase-1 in high glucose-induced disorder of of tPA/PAI-1 in rat mesangial cells.

ZHU Heng-mei,ZHU Sheng-lang,CHEN Jie-hui,YE Ling,JIANG Ying,LI Xiang-yang.

Department of Nephrology,the Sixth Hospital of Shenzhen City,Shenzhen 510082,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the role of Poly(ADP-ribose)Polymerase-1(PARP-1)in high glucose-induced disorder of tPA/PAI-1 in rat mesangial cells(RMCs).MethodsRMCs were constructed and then treated with or without high glucose(25 mmol/L).In some experimental groups,cells were pre-treated with PARP-1 inhibitor PJ34(3×10-6mol/L).RT-PCR was employed to detect the expression of PARP-1 mRNA,Western blot was used to detect the expression PARP-1 protein,and Colorimetric assay for its activity.Meanwhile,tPA and PAI-1 protein secretion were examined by ELISA.ResultsHigh glucose significantly stimulated the overexpression of both PARP-1 mRNA and protein in RMCs.At the same time,high glucose obviously stimulated PARP-1 activation,and PJ34 effectively inhibited the activation of PARP-1.Also,PJ34 suppressed high glucose-induced downregulation of tPAprotein secretion,upregulation of PAI-1 protein secretion and reversed the reduction of tPA/PAI-1 ratio.ConclusionPARP-1 mediates high glucose-induced disorder of tPA/PAI-1 in rat mesangial cells.

Mesangial cells;PARP;High glucose;tPA/PAI-1;Fibrinolytic system

R-322

A

1003—6350（2012）20—018—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.20.007

2012-05-17)

深圳市科技局科技立項(編號：201102134)；深圳市南山區(qū)計劃項目(編號：南衛(wèi)2011004)

朱恒梅(1970—)，女，江西省贛州市人，主治醫(yī)師，博士。

*通訊作者：祝勝郎，男，主任醫(yī)師，碩士導(dǎo)師。E-mail：zhushenglang@yahoo.com.cn