遲國達，王 鵬，徐 偉，2，黃臣勇

(1.哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，150076哈爾濱)

工業(yè)上生產(chǎn)乳酸［1］主要采用微生物發(fā)酵法，本實驗室利用微波誘變選育出的乳酸高產(chǎn)菌株干酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei subsp rhamnosus)W4-3-9菌株對玉米淀粉生產(chǎn)廢水進行發(fā)酵制備乳酸［2］.成熟的發(fā)酵液中通常還含有菌體、蛋白質、色素、殘?zhí)呛蜔o機鹽等雜質，如何將乳酸從發(fā)酵體系中提取出來是制約乳酸工業(yè)發(fā)展的重要因素，也是關注的熱點［3-4］.乳酸的提取過程是整個工藝中最耗費成本的［5］，研究者采用不同的分離技術對乳酸進行分離，如反應萃取、膜技術、離子交換、電滲析和蒸餾等［6-11］.其中，離子交換法因具有選擇性高、交換容量大、操作簡便、易于自動控制等優(yōu)點而受到關注［12］，廣泛應用于生物制品分離領域［13-14］.Cao Xunjun等［15］在pH高于和低于pKa(3.86)的情況下，分別研究了陰離子交換樹脂Amberlite IRA-4從發(fā)酵液中分離提取L-乳酸的情況，研究表明，與鈣鹽法相比，離子交換法有一定的優(yōu)勢，產(chǎn)品的收率亦大大提高.Kulprothipanja等［16］在專利中用具有叔胺功能基或吡啶功能基的弱堿性陰離子交換樹脂(Amberlite IRA-35)或一個季胺功能基的強堿性陰離子交換樹脂(Amberlile IRA-958)進行了離子交換提取乳酸的工藝研究，該工藝的優(yōu)點是:選擇性強;一種樹脂即可完成，沒有轉型工藝;整個工藝采用連續(xù)逆流多級流動床系統(tǒng).王子鎬等［17］研究了從“葡萄糖-乳酸”溶液中提取乳酸的離子交換工藝，篩選了一種樹脂為201X4，吸附量為0.25 g/mL，而對葡萄糖基本不吸附.利用該樹脂參與乳酸的發(fā)酵，可以連續(xù)將發(fā)酵液中的乳酸分離出來，從而維持發(fā)酵所需的pH值，未參加的葡萄糖則返回發(fā)酵罐繼續(xù)參與發(fā)酵，便可能實現(xiàn)乳酸的連續(xù)發(fā)酵.但樹脂201X4對乳酸的交換容量不令人滿意，需進一步研究.

采用離子交換樹脂法分離提取玉米淀粉發(fā)酵液中的乳酸，以乙酸、丙酮酸、檸檬酸和乳酸為研究對象，探討315型陰離子交換樹脂對這幾種有機酸的靜態(tài)吸附等溫線及吸附動力學特性，考察不同操作條件及洗脫條件對發(fā)酵液中乳酸分離純化效果的影響.

1 實驗

1.1 材料與儀器

PS系大孔弱堿性陰離子交換樹脂(德國朗盛Lewatit樹脂公司)、PS系大孔吸附樹脂和國產(chǎn)弱堿性陰離子交換樹脂(蚌埠遼源新材料有限公司)、乙酸(分析純，丹東市勝利化工廠)、乳酸(分析純，北京化學試劑公司)、丙酮酸(生化試劑，天津光復精細化工研究所)、檸檬酸(分析純，哈爾濱市化工試劑廠)、葡萄糖酶試劑盒(生化試劑，吉林省惠強生物技術有限公司).

恒溫振蕩儀(哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司，HZQ-QG)、蠕動泵(鄭州南北儀器設備有限公司)、高效液相色譜儀(SHIMADZU LG-10A).

1.2 分析方法

乳酸等有機酸質量濃度采用高效液相色譜法測定［18］，葡萄糖采用酶-比色法測定(食品中葡萄糖的測定方法GB/T 16285—96).

1.3 發(fā)酵液中主要成分的測定

廢水發(fā)酵液先經(jīng)離心機以轉速4 000 r/min離心20 min，后稀釋100倍，并通過0.45 μm濾膜過濾.參照相關文獻研究，選取乳酸(Lactic acid)、甲酸(Formic acid)、乙酸(Acetic acid)、丙酸(Propionic acid)、正丁酸(n-Butyric acid)、丙酮酸(Pyruvic acid)、草酸(Oxalic acid)和檸檬酸(Citric acid)制作標準曲線.然后，采用液相色譜法對廢水發(fā)酵液中有機成分的性質與質量濃度進行測定.

1.4 樹脂的篩選

分別稱取1.000 g樹脂(濕質量)，放入4個50 mL三角瓶中，分別加入相同濃度(0.5 mol/L)的乳酸、乙酸、檸檬酸和丙酮酸溶液各20 mL，即加入45 g/L乳酸、30 g/L乙酸、96.07 g/L檸檬酸、44.03 g/L丙酮酸溶液各20 mL，用鹽酸調節(jié)pH至1.88(未經(jīng)pH調節(jié)時的發(fā)酵液pH原始值).25℃下?lián)u床振蕩24 h，測定上層溶液中各有機酸質量濃度ρe(g/L)，按下式計算平衡吸附量:式中:Qe為平衡吸附量(mg/g);ρ0為吸附體系中所加有機酸溶液的初始質量濃度(g/L);ρe為吸附體系中吸附平衡后上清液中有機酸質量濃度(g/L);V為吸附體系中所加有機酸溶液體積(L);m為吸附體系中所加樹脂質量(g).

1.5 吸附等溫線的測定

稱取1.000 g樹脂放入若干0.05 L三角瓶中，再分別加入不同質量濃度的乳酸(10、20、40、60、80 g/L)各0.015 L，分別于25、30和40℃下吸附24 h.吸附平衡后測定殘液中有機酸質量濃度，根據(jù)式(1)計算平衡吸附量Qe，繪制吸附等溫線.

1.6 吸附動力學

稱取2.000 g樹脂放入兩個0.10 L三角瓶中，分別加入40 g/L乳酸、丙酮酸、檸檬酸和20 g/L乙酸各0.030 L，25℃下于搖床上吸附.不同時間取樣測定各有機酸質量濃度，直至吸附平衡，計算t時刻的吸附量Qt，并繪制吸附曲線.

1.7 動態(tài)實驗

動態(tài)實驗所用的色譜柱內(nèi)徑2.0 cm，柱長60.0 cm.取已預處理的315型樹脂裝入已標好刻度的玻璃色譜柱中，濕法裝柱至0.10 L.使發(fā)酵液和洗脫劑以不同流量通過吸附柱，每0.050 L柱底流出液收集為一個樣，測定其有機酸質量濃度，并繪制流出曲線.

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵液中主要成分分析

實驗所用廢水為玉米淀粉生產(chǎn)廢水，微生物代謝過程的多途徑性使得發(fā)酵液中的有機成分相對復雜，這些有機物將影響離子交換樹脂法分離提取乳酸的效果.參考相關文獻采用高效液相色譜法對發(fā)酵液中的有機成分進行分析測定.根據(jù)液相色譜的結果選取質量濃度較大且與乳酸性質相近的有機酸作為考查對象.

所得液相色譜圖見圖1，發(fā)酵液中各主要成分質量濃度見表1.

圖1 發(fā)酵液的液相色譜圖

表1 實際廢水發(fā)酵液中主要有機物質量濃度g·L-1

因為原水是玉米淀粉生產(chǎn)廢水發(fā)酵液，含有一定量的殘?zhí)牵瑥谋?可以看出:有機酸中的乙酸、檸檬酸和丙酮酸質量濃度相對較大，且其性質與乳酸接近，故后續(xù)實驗選擇葡萄糖、乙酸、檸檬酸和丙酮酸配置模擬發(fā)酵液用于考察不同樹脂分離提取乳酸的效果，并進行樹脂的選擇以及動態(tài)吸附、洗脫實驗.后續(xù)實驗采用的均為模擬發(fā)酵液.

2.2 樹脂的篩選

本實驗使用的樹脂有弱堿性陰離子交換樹脂(MP64、S4528、339型、315型、318型)和大孔吸附樹脂(CAD-40、D101及BS-65)，通過其對乳酸、乙酸、檸檬酸和丙酮酸的靜態(tài)交換容量確定用于乳酸分離提取的最佳樹脂，每種有機酸的靜態(tài)交換容量實驗均用鹽酸調節(jié)pH至1.88，這是發(fā)酵液的原始pH值，同動態(tài)實驗pH值環(huán)境相同，在此條件下探求樹脂對幾種有機酸的靜態(tài)交換容量，結果見表2.

由表2可以看出:在pH為1.88條件下，對有機酸的吸附能力，陰離子交換樹脂比大孔吸附樹脂強.原因在于弱堿性樹脂主要吸附未離解的有機酸分子，而低pH利于有機酸以分子狀態(tài)存在，同時大孔吸附樹脂不具備高度專一性，而陰離子交換樹脂交換基團為弱堿性，使其對有機酸的吸附更具選擇性.5種陰離子交換樹脂中，315型和S4528型對乳酸的靜態(tài)交換容量較其他幾種大，而315型對乙酸、檸檬酸及丙酮酸的靜態(tài)交換容量均較S4528型小.實驗選取315型陰離子交換樹脂用于乳酸的分離提取.本實驗選用的315型陰離子交換樹脂對乳酸的靜態(tài)交換容量可達274.9 mg/g，顯著高于鄭輝杰等［12］選用的D301G對發(fā)酵液中乳酸的靜態(tài)交換容量234 mg/g.

2.3 吸附等溫線實驗

在25、30和40℃下315型樹脂對乳酸的吸附等溫曲線見圖2.可以看出，隨著乳酸質量濃度的增加，315型樹脂對乳酸的吸附量也逐漸增加，并且隨溫度的增加，其吸附量減少.說明乳酸在315型樹脂上的吸附過程是放熱反應，低溫利于其進行，故乳酸的提取過程在室溫進行即可.此實驗結果同鄭輝杰等［12］選用的D301G樹脂對乳酸的吸附作用相反.

圖2 315 型陰離子交換樹脂對乳酸的吸附等溫線

根據(jù)Freundlich經(jīng)驗等溫式(2)對上述數(shù)據(jù)進行擬合:

式中:k為平衡吸附常數(shù)，n為特征常數(shù)，其他常數(shù)定義同式(1).結果見表3.

表3 315 型樹脂吸附乳酸的Freundlich經(jīng)驗方程擬合參數(shù)

由表3可以看出，315型樹脂對乳酸的吸附等溫線符合Freundlich方程.方程的特征參數(shù)n＞1，表明是優(yōu)惠吸附［19］.

進一步在25℃下測定了315型陰離子交換樹脂對乙酸、乳酸、丙酮酸及檸檬酸的吸附等溫線，見圖3.并對其數(shù)據(jù)進行Freundlich經(jīng)驗式擬合，結果見表4.可以看出，n值大小關系為:乙酸＜乳酸＜丙酮酸＜檸檬酸，說明檸檬酸、丙酮酸比乳酸更易于吸附在315型樹脂上，而乙酸相對乳酸而言，被315型樹脂吸附的能力較弱.這與4種酸的酸性相關(見表5)，酸性強的有機酸更易于被315型陰離子交換樹脂吸附.

圖3 315 型樹脂對幾種有機酸的吸附等溫線

表4 Freundlich經(jīng)驗方程擬合參數(shù)

表5 主要有機酸成分的保留時間及Ka值

2.4 吸附動力學實驗

圖4 為25℃下，有機酸在315型樹脂上的吸附量Qt隨吸附時間t的變化曲線.可以看出，315型樹脂對有機酸的吸附速率較慢，60 min時的吸附量為平衡吸附量的90%，達到平衡吸附的時間為120 min.

圖4 25 ℃下有機酸在315型樹脂上的吸附曲線

液相吸附由3個基本過程組成:吸附質在吸附劑粒子表面液膜內(nèi)擴散、粒子內(nèi)的細孔擴散和表面擴散、在細孔表面的吸附，其中慢者為吸附速率的控制步驟.分別采用Boyd液膜擴散方程［20］和Kannan-Sundaram粒內(nèi)擴散模型［21］討論315型樹脂對幾種有機酸的吸附.

Boyd液膜擴散方程:

Kannan-Sundaram粒內(nèi)擴散模型:

式中:F=Qt/Qe表示吸附劑的吸附交換率;k'表示膜擴散速率常數(shù);kp為粒內(nèi)擴散速率常數(shù);C為方程的截距.

分別以-ln(1-F)對t作圖和Qt對t0.5作圖，對應關系見圖5、6，擬合得到的方程及相關系數(shù)見表6.可以看出，-ln(1-F)對t擬合方程的相關系數(shù)均大于Qt對t0.5擬合方程的相關系數(shù)，前者的線性關系相關性好于后者，說明315型樹脂對有機酸吸附的主要控制步驟是液膜擴散，其吸附動力學符合Boyd液膜擴散模型.另外，圖6的直線不經(jīng)過原點，表明顆粒內(nèi)擴散過程對有機酸在315型樹脂上的吸附有一定的影響，液膜擴散過程并不是該過程的唯一控制步驟.

圖5 25 ℃時315型樹脂吸附有機酸的Qt-t0.5曲線

圖6 25 ℃時315型樹脂吸附有機酸的-ln(1-F)-t曲線

表6 25℃下有機酸的靜態(tài)吸附動力學擬合結果

2.5 動態(tài)吸附實驗

2.5.1 上柱流速的確定

在pH=1.88條件下，發(fā)酵液分別以流速1、1.5、2、3 BV/h上柱，乳酸及乙酸的流出曲線分別見圖7、8.

圖7 不同上柱流速下流出液中乳酸質量濃度變化

圖8 不同上柱流速下流出液中乙酸質量濃度變化

以流出液中乳酸含量達5%作為穿透點，由圖7可知，在pH值1.88條件下，隨流速的增加乳酸穿透點的總流量不斷提前，其中流速為1.5 BV/h時乳酸的穿透點與1 BV/h時相同，均在300 mL處，即吸附相同量的乳酸用時更短，在乳酸分離提取過程中更具有效率.由圖8可知，乙酸穿透點的規(guī)律與乳酸相近，與乳酸相比其更早達到穿透點.同時，在乙酸的流出曲線中存在其質量濃度大于進樣質量濃度的情況(達110%).初步分析認為，當乳酸和乙酸同時存在時，乳酸將與其競爭吸附到315型陰離子交換樹脂上，并因樹脂對乳酸的吸附作用更強而替換吸附到樹脂上的乙酸，從而使得流出液的瞬時質量濃度大于其進樣質量濃度.在流出液中一直未檢出丙酮酸和檸檬酸，其全部吸附于樹脂上.丙酮酸和檸檬酸因其酸性強于乳酸［22］，能夠優(yōu)先吸附于弱堿性樹脂上，并能對乳酸進行替換，形成競爭吸附.實驗還發(fā)現(xiàn)，葡萄糖在樹脂上能很快達到吸附飽和，流出液中葡萄糖質量濃度快速與進樣中質量濃度相同，315型陰離子交換樹脂對葡萄糖基本無吸附作用.

綜上，最佳上柱流速選為1.5 BV/h，并在此基礎上確定最佳上柱pH值.

2.5.2 上柱pH的確定

在上柱流速1.5 BV/h條件下，發(fā)酵液分別以pH1.88、3、4上柱，收集流出液，測定其有機酸質量濃度隨時間的變化，結果見圖9、10.可以看出，隨pH的升高，乳酸的穿透體積越來越小，由pH 1.88的300 mL減少到100 mL左右，而乙酸的流出曲線趨于一致.同時發(fā)現(xiàn)檸檬酸、丙酮酸和葡萄糖的流出質量濃度與之前無變化.分析知弱堿性樹脂主要吸附未離解的有機酸分子，而低pH利于有機酸以分子狀態(tài)存在.故選取上柱pH值1.88、上柱流速1.5 BV/h作為315型樹脂分離提取乳酸的最佳上柱條件.

圖9 不同上柱pH下流出液中乳酸質量濃度變化

圖10 不同上柱pH下流出液中乙酸質量濃度變化

2.6 動態(tài)洗脫實驗

由表7可知，實驗選取的5種洗脫劑均有很好的洗脫效果［12］，相對于有機洗脫劑乙醇，無機的酸、堿洗脫劑效果更好.去離子水作為洗脫劑能很好地解吸樹脂上吸附的乳酸，同時考慮到乳酸純度及提取成本問題，選取去離子水作為乳酸的洗脫劑.

表7 洗脫劑洗脫效果

離子交換柱以最佳上柱條件(pH 1.88、1.5 BV/h)上柱300 mL模擬發(fā)酵液，然后用20 mL去離子水快速淋洗樹脂層，再分別用去離子水以0.5、1及1.5 BV/h的流速進行洗脫，結果見圖11.

圖11 去離子水作為洗脫劑情況下有機酸流出曲線

由圖11可以看出，在用去離子水洗脫過程中，只有乙酸和乳酸被淋洗下來，丙酮酸和檸檬酸均未在流出液中檢出，同時乙酸的流出質量濃度峰值出現(xiàn)較乳酸早.對比不同流速下的乳酸流出曲線可知，隨流速的降低，乳酸峰值質量濃度增加，洗脫峰逐漸變窄，但是拖尾現(xiàn)象較高流速嚴重.出現(xiàn)此種結果與乳酸、乙酸、丙酮酸以及檸檬酸之間競爭吸附過程相關，酸性強的物質便不易于被洗脫.由此洗脫下來的溶液中只存在乳酸、乙酸以及少量的葡萄糖.

通過動態(tài)吸附及洗脫實驗，分析流出液及樹脂中有機酸質量濃度，見表8.可以看出，提取液中乳酸質量濃度為19.5 g/L，是上柱液中乳酸質量濃度(40 g/L)的1/2，而純度由72.4%提高到83.6%，所含有機酸種類減少，提取液經(jīng)濃縮結晶后可以提取出純度較高的乳酸產(chǎn)品.從吸附到洗脫全過程中乳酸提取率為72.4%(吸附99.0%，洗脫73.0%).

表8 有機酸的分離提取效率

3 結論

1)溫度升高，315型陰離子交換樹脂對乳酸等有機酸的吸附量減少，吸附過程為放熱過程，故吸附實驗在室溫下進行即可.

2)315 型陰離子交換樹脂對乳酸等有機酸的吸附過程符合Freundlich吸附等溫方程，方程的特征參數(shù)n＞1，是一種“優(yōu)惠吸附”，315型樹脂對有機酸的吸附能力由強到弱為:檸檬酸、丙酮酸、乳酸、乙酸.

3)315 型陰離子交換樹脂對乳酸等有機酸吸附過程的主要控制步驟是液膜擴散，其吸附動力學符合Boyd液膜擴散模型.同時，粒內(nèi)擴散并不是該過程唯一的控制步驟.

4)25℃下的動態(tài)吸附及洗脫實驗表明，上柱流速及pH值均影響乳酸在315型陰離子交換樹脂上的吸附效果.以1.5 BV/h、pH 1.88上柱吸附，再用1 BV/h的去離子水洗脫，可實現(xiàn)發(fā)酵液中乳酸的良好分離.

［1］TONG Wangyu，F(xiàn)U Xiangyang，LEE S M，et al.Purification of L(+)-lactic acid from fermentation broth with paper sludge as a cellulosic feedstock using weak anion exchanger Amberlite IRA-92［J］.Biochemical Engineering Journal，2004，18(2):89-96.

［2］張興，王鵬，徐偉.微波輻照選育L-乳酸高產(chǎn)菌的生物學特性研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報:自然科學版，2008，24(3):305-308.

［3］吳宇瓊，李定或.發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的提取與精制研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2003，24(1):106-108.

［4］曾煒，陳豐秋，詹曉力.乳酸的生產(chǎn)技術及其研究進展［J］.化工進展，2006，25(7):744-749.

［5］GONZALEZ M I，ALVAREZ S，RIERA F A，et al.Purification of lactic acid from fermentation broths by ion-exchange resins［J］.Industrial＆Engineering Chemistry Research，2006，45(9):3243-3247.

［6］DATTA R.Recovery and purification of lactate salts from whole fermentation broth by electrodialysis［R］.U.S.Patent 4，885，257，1989.

［7］KULPRATHIPANJA S.Separation of lactic acid from fermentation broth with an anionic polymeric absorbent［R］.U.S.Patent 5，068，418，1991.

［8］NISPEN van J G M，JONKER R.Process for the fermentative preparation of organic acids［R］.U.S.Patent 5，002，881，1999.

［9］RUSSO L J，KIM H.Membrane-based process for the recovery of lactic acid by fermentation of carbohydrate substrates containing sugars［R］.U.S.Patent 5，503，750，1996.

［10］BANIEL A M，EYAL A M，MIZARAHI J，et al.Lactic acid production，separation and recovery process［R］.U.S.Patent 6，187，951，2001.

［11］EYAL A M，STARR J N，F(xiàn)ISHER R，et al.Lactic acid processing methods arrangements and products［R］.U.S.Patent 6，229，046，2001.

［12］鄭輝杰，李志強，何姍，等.離子交換法提取發(fā)酵液中乳酸的工藝研究［J］.食品科學，2009，30(6):84-88.

［13］HOUWING J，BILLIET H A H，WIELEN van der L A M.Optimization of azeotropic protein separations in gradient and isocratic ion-exchange simulated moving bed chromatography［J］.J Chromatogr，2002，944(1/2):189-201.

［14］TONG Wangyu，YAO Shanjing，ZHU Ziqiang.Separation characteristics of human epidermal growth factor in ion exchange chromatography with STREAMLINE DEAE resin［J］.Chem Eng Sci，2001，56(24):6959-6965.

［15］CAO Xunjun，YUN H S，KOO Y M.Recovery of LLactic acid by anion exchange resin Amberlite IRA-400［J］.Biochemical Engineering Journal，2002，11(2/3):189-196.

［16］曹本昌，費克暉，匡群.我國發(fā)酵乳酸提取方法的現(xiàn)狀及新技術［J］.江蘇食品與發(fā)酵，1997(1):22-28.

［17］王子鎬.離子交換法分離乳酸的研究［J］.離子交換吸附，1991，7(4):26 6-271.

［18］李友元，陶萍.高效液相色譜法測定螺旋霉素發(fā)酵液中的有機酸［J］.色譜，2002，20(1):46-48.

［19］楊鵬波，張曉燕，叢威，等.大孔吸附樹脂吸附乳酸及乳酸與谷氨酸的分離［J］.過程工程學報，2007，7(4):767-772.

［20］李明愉，曾慶軒，馮長根，等.離子交換纖維對阿魏酸的吸附和解吸研究［J］.中國藥學雜志，2005，40(1):40-43.

［21］王學江，張全興.NDA-100大孔樹脂對水溶液中水楊酸的吸附行為研究［J］.環(huán)境科學學報，2002，22(5):658-660.

［22］馬翠卿，李景晨，邱建華，等.離子交換法分離乳酸轉化液中的丙酮酸［J］.離子交換與吸附，2005，21(3):241-247.