郭長虹，劉慶國，劉佳莉，束永俊，呂月萍，余建平

(哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室，150025哈爾濱)

目前，轉基因植物風險評估［1-2］主要集中在轉基因植物與近緣物種的基因轉移［3］、目標害蟲的抗性［4］，以及對非目標生物的多樣性和生態(tài)系統(tǒng)的影響［1，2，5］.土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質循環(huán)和能量轉化過程的重要場所，而土壤生物多樣性與活性是該系統(tǒng)保持健康穩(wěn)定的基礎［6］.轉基因作物根系分泌物的釋放有可能引起微生物多樣性和結構的改變，所以，轉基因作物對土壤生態(tài)環(huán)境、土壤微生物群落結構和多樣性的改變是轉基因作物生態(tài)評價中重要的內容［7］.到目前為止，研究主要集中在核轉基因植物對土壤微生物的影響，而葉綠體轉基因植物對土壤微生物影響的報道很少.由于葉綠體基因組的拷貝數(shù)高，葉綠體轉基因植物的外源基因表達量非常大，可達核轉基因植物的幾十倍、甚至幾百倍.大量的外源基因表達產物進入土壤，可能使土壤微生物群落結構發(fā)生變化，最終導致生態(tài)系統(tǒng)功能的改變.因此，評價葉綠體轉基因植物對土壤微生物群落的影響具有重要的生態(tài)學意義.

本研究以aadA基因葉綠體轉化煙草為材料，利用微生物稀釋平板法和Biolog檢測，比較aadA基因葉綠體轉化煙草與對照煙草在苗期、花期和成熟期土壤微生物群落和功能的變化，為評價葉綠體轉基因煙草對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響提供依據(jù).

1 試驗

1.1 植物材料及種植

葉綠體轉基因煙草(轉aadA基因，TA)及對照煙草(WT)由本實驗室提供.田間種植采用完全隨機區(qū)組，3個重復，轉基因煙草和非轉基因煙草相間種植.

1.2 土壤采集

分別在煙草的苗期、花期、成熟期隨機抽取大田種植的煙草，采用抖落法取根系表層1～2 mm土壤［8］，每次每個重復取3株煙草并將其根際土壤混合，過2 mm土壤篩備用.

1.3 微生物數(shù)量測定

采用平板稀釋分離培養(yǎng)法.土壤微生物數(shù)量分細菌、真菌和放線菌3大類群測定，采用平板稀釋法統(tǒng)計數(shù)量.細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng);真菌用孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng);放線菌用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)［9］.

1.4Biolog分析

稱取5 g土壤加入到裝有45 mL滅菌NaCl溶液的三角瓶中(濃度為0.145 mol/L)，然后在旋轉振蕩器上震蕩30 min搖勻.土壤溶液依次稀釋至10-3，向Biolog EcoPlate(美國BIOLOG公司)上每孔加入150 μL土壤稀釋液，然后在室溫條件下(28℃)將微孔板放在保濕容器中避光培養(yǎng)，每隔24 h用酶標儀讀取在590 nm(顏色+濁度)和750 nm(濁度)波長的數(shù)值.

單孔平均光密度值計算按照Garland和Mills的方法［10］，即每孔平均吸光度變化率RAWCD(590～750 nm)=Σ(C590～750)/31，其中31為Biolog EcoPlate上供試碳源的種類數(shù).

采用培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)計算微生物群落的多樣性指數(shù)［11］.Shannon指數(shù)H'用于評估豐富度，H'=-Σ(Pi×ln Pi)E=H'/ln s，其中Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率，s為顏色變化孔的數(shù)目;Simpson指數(shù)D是用于評估常見種優(yōu)勢度的指數(shù)，D=1-Σ(Pi×Pi)，其中Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率;Mcintosh指數(shù)U是基于群落物種多維空間距離的多樣性指數(shù)，為一致性的量度，，其中ni為第i孔的相對吸光值.

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Excel和SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理和差異統(tǒng)計學意義分析(P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義).同列數(shù)據(jù)后具有相同字母者，表示在0.05水平上差異無統(tǒng)計學意義.RAWCD折線圖采用SigmaPlot 2000軟件，PCA圖由MATLAB軟件做出.

2 結果與分析

2.1 aadA葉綠體轉基因煙草對根際土壤微生物數(shù)量的影響

對苗期、花期、成熟期土壤中微生物數(shù)量進行統(tǒng)計(表1).結果表明，在各個生育期內，細菌數(shù)量苗期最小，花期最大，成熟期有所降低;放線菌、真菌數(shù)量苗期最低，花期增加，成熟期最大.所有在3個不同時期的WT根際微生物的數(shù)量均略高于TA根際的微生物數(shù)量，這一趨勢很明顯，但都沒有達到差異有統(tǒng)計學意義水平.說明在試驗期間aadA葉綠體轉化煙草的種植對各個時期的根際土壤微生物數(shù)量沒有影響.

表1 煙草根際微生物數(shù)量分析

2.2 aadA葉綠體轉基因煙草對根際土壤微生物活性的影響

對苗期、花期、成熟期aadA葉綠體轉基因煙草土壤微生物進行Biolog分析(圖1).結果表明，各個時期內aadA葉綠體轉化煙草根際土壤微生物群落的RAWCD變化曲線與野生型煙草根際土壤的RAWCD變化曲線接近吻合.說明在試驗期間aadA葉綠體轉化煙草對土壤微生物的整體活性影響很小，轉基因煙草根際土壤中的微生物群落對微平板上碳底物利用的能力和對照土壤差異無統(tǒng)計學意義.

圖1 不同生育期煙草根際土壤微生物RAWCD隨時間的變化

2.3 土壤微生物群落功能多樣性分析

進一步對不同生育期煙草土壤細菌群落Biolog EcoPlate底物碳源代謝主成分進行了分析(圖2).結果表明，aadA葉綠體轉基因煙草和對照煙草在苗期、花期和成熟期主成分都有交集，說明在這3個時期轉基因與非轉基因煙草根際土壤細菌群落對底物碳源的代謝特征差異無統(tǒng)計學意義.

圖2 不同生育期煙草土壤微生物群落碳源利用的主成分分析

對苗期、花期、成熟期3個時期兩種土壤微生物功能多樣性進行了分析(表2).結果表明，aadA葉綠體轉化煙草和野生型煙草根際微生物種群在Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Mcintosh指數(shù)和Shannon均勻度方面差異無統(tǒng)計學意義.說明在試驗期間aadA葉綠體轉化煙草的種植對根際土壤微生物功能多樣性沒有影響.

表2 根際微生物群落多樣性指數(shù)分析

3 討論

自轉基因作物商業(yè)化種植以來，其對環(huán)境的影響一直備受關注.現(xiàn)已知多種作物的多個轉基因品系及其殘體可以改變作物土壤微生物群體的組成，但這些改變也同時受田間土壤性質、季節(jié)變化和評估方法等的影響［12］.Yudina等［13］發(fā)現(xiàn)4種不同轉Bt基因棉花促使了土壤中細菌和真菌數(shù)量發(fā)生短暫性的顯著增加.Dunfield和Gernuda［14］研究了在加拿大的4個不同田塊連續(xù)兩年種植4種轉抗除草劑基因的油菜和4種常規(guī)油菜品種對根際微生物多樣性的影響.結果表明，轉基因油菜品種細菌群落與常規(guī)品種有差異.轉基因油菜的根際微生物群落在一些脂肪酸上顯著偏高，表明其微生物群落組成發(fā)生了變化.近年來，國內學者也陸續(xù)報道了轉基因植物對土壤微生物的影響的研究成果.王洪興等［15］的研究表明，土壤中施入轉Bt基因稻稈后細菌數(shù)量顯著低于施入非轉基因稻稈后土壤中的細菌數(shù)量，但對于真菌結果正好相反，放線菌數(shù)量變化差異無統(tǒng)計學意義.沈法富等［7］在大田栽培條件下，連續(xù)兩年測定棉花不同發(fā)育時期轉Bt基因抗蟲棉GK12和對照品種泗棉三號之間對土壤微生物的影響，結果表明，轉基因抗蟲棉根際微生物和細菌生理群的數(shù)量發(fā)生了變化，且根際細菌生理群分布的均勻度下降.袁紅旭等［16］對轉幾丁質酶和葡聚糖酶雙價抗真菌基因水稻種植后的根際土壤微生物群落進行了分析.結果表明，轉基因水稻根際土壤中真菌和細菌數(shù)量明顯少于非轉基因對照，與常規(guī)水稻品種數(shù)量接近.陳敏等［17］的研究結果顯示，轉Bt水稻根際土壤的細菌生理類群無論在數(shù)量或是結構組成上均明顯不同于常規(guī)水稻.李本金等［18］通過溫室模擬試驗，評估了抗真菌轉基因水稻對根際土壤細菌、放線菌、真菌數(shù)量的影響.結果表明，在水稻整個生長發(fā)育過程中，供試轉基因水稻根際土壤細菌、放線菌、真菌數(shù)量與相應非轉基因水稻相比差異無統(tǒng)計學意義.本研究以aadA葉綠體轉基因煙草和非轉基因對照煙草為材料，分別于苗期、花期、成熟期對種植在大田中的aadA葉綠體轉基因煙草與對照煙草根際土壤可培養(yǎng)的微生物進行了分析.結果表明，所有在3個不同時期的WT根際微生物的數(shù)量均要略高于TA根際的微生物數(shù)量，但都沒有達到差異統(tǒng)計學意義水平，說明在試驗期間aadA葉綠體轉基因與對照植株根際土壤微生物在數(shù)量上差異無統(tǒng)計學意義.

微生物功能多樣性信息對于明確不同環(huán)境中微生物群落的作用具有重要意義.以Biolog微孔板碳源利用為基礎的定量分析為描述微生物群落功能多樣性提供了一種更為簡單、快速的方法，并廣泛應用于評價土壤微生物群落的功能多樣性［19-21］.Griffiths等［22］利用Biolog法研究表明，轉凝集素基因馬鈴薯對根際微生物群落功能多樣性沒有產生影響.阮妙鴻等［23］利用Biolog結合微生物的平板培養(yǎng)研究了轉ScMV-CP基因甘蔗對根際土壤微生物的影響.結果表明，轉基因甘蔗對土壤微生物的數(shù)量和均勻度有一定影響，但對其活性和多樣性則影響不明顯.本研究利用Biolog技術分析了aadA葉綠體轉基因煙草的種植對根際土壤微生物群落功能多樣性的影響.結果表明，在3個不同時期aadA葉綠體轉基因煙草與對照煙草根際土壤微生物在RAWCD變化曲線、主成分、微生物群落指數(shù)等方面均有一定差異，但差異均沒有達到統(tǒng)計學意義水平.說明在試驗期間aadA葉綠體轉基因煙草的種植對根際微生物群落功能多樣性沒有影響.

本研究首次在大田條件下研究了不同生育期aadA葉綠體轉基因煙草對土壤微生物數(shù)量和功能多樣性的影響.今后，還將對不同基因型的葉綠體轉基因煙草采用更多的方法(如DGGE)，進行更長時間的跟蹤，從而更加全面、客觀地評價葉綠體轉基因植物對土壤微生物群落的影響.

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