高 輝，王 楊，黃云昆，朱雯梅，徐 敏

（昆明市延安醫(yī)院 檢驗(yàn)科，云南 昆明 650051）

產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌中16SrRNA甲基化酶基因的檢測(cè)

高 輝，王 楊，黃云昆，朱雯梅，徐 敏

（昆明市延安醫(yī)院 檢驗(yàn)科，云南 昆明 650051）

產(chǎn) 超 廣 譜 β－內(nèi) 酰 胺 酶 （extended-spectrumβlactamases，ESBLs）的革蘭陰性桿菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，表現(xiàn)為多重耐藥，給臨床抗感染治療帶來(lái)了極大的困擾。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一類由質(zhì)粒介導(dǎo)的16SrRNA甲基化酶可使細(xì)菌的30S核糖體16SrRNA不與氨基糖苷類藥物結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物出現(xiàn)高水平耐藥，有研究顯示16SrRNA甲基化酶基因常與ESBLs基因位于同一質(zhì)粒上，可在不同菌種間水平傳播或同種間克隆傳播從而造成多重耐藥性的傳播。本研究對(duì)臨床標(biāo)本中分離的56株產(chǎn)ESBLs革蘭陰性腸桿菌進(jìn)行了16SrRNA甲基化酶基因篩查，以了解其流行情況，為進(jìn)一步研究昆明地區(qū)該耐藥基因的分布情況奠定基礎(chǔ)，為提高臨床抗感染治療效果提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2010年1月－2010年10月昆明市延安醫(yī)院（三甲綜合醫(yī)院）臨床標(biāo)本中分離的ESBLs陽(yáng)性非重復(fù)性革蘭陰性腸桿菌56株，包括大腸埃希式菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、奇異變形桿菌。藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，ESBLs表型確認(rèn)試驗(yàn)質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.2 藥敏紙片和培養(yǎng)基

藥敏紙片中亞胺培南、美洛培南、環(huán)丙沙星、為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品，其余藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。藥敏試驗(yàn)用M-H培養(yǎng)基，為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)

用法國(guó)生物梅里埃VITEK32細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，藥敏試驗(yàn)采用K-B瓊脂擴(kuò)散法，按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI2009）的標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 ESBLs檢測(cè)

采用CLSI推薦的雙紙片擴(kuò)散法，使用CTX和CTX／CA、CAZ和CAZ／CA兩對(duì)紙片進(jìn)行ESBLs表型確認(rèn)試驗(yàn)，嚴(yán)格按照CLSI推薦的操作和結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，以肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 提取細(xì)菌基因組DNA

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，按試劑盒說(shuō)明書操作，試劑盒由天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.6 基因檢測(cè)

用Biometra Personal Cycler PCR儀擴(kuò)增6種16SrRNA甲基化酶基因和TEM型β－內(nèi)酰胺酶基因，Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，PCR擴(kuò)增引物由北京百泰克生物技術(shù)有限公司合成，靶基因引物序列見表1［1］。TEM基因PCR擴(kuò)增體系為：2×Taq Master Mix 25μl，模板0.5μl，P1引物2μl，P2引物2μl，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50μl。熱循環(huán)參數(shù)為：94℃2min，然后94℃60s→55℃60s→72℃60s，循環(huán)35個(gè)周期，最后72℃10min。6種16SrRNA甲基化酶基因PCR擴(kuò)增體系均為：2×Taq Master Mix 25μl，模板0.5 μl，P1引物2μl，P2引物2μl，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50μl。熱循環(huán)參數(shù)均為：95℃預(yù)變性3min，然后95℃60s→55℃60s→72℃60S。循環(huán)30次，72℃延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，Bio-Rad Laboratories 6000凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并攝像保存。出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽(yáng)性，armA基因陽(yáng)性對(duì)照DNA由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院俞云松教授惠贈(zèng)。

2 結(jié)果

2.1 β－內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果

56株表型確認(rèn)產(chǎn)ESBLs革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌均檢測(cè)出TEM基因，其PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

2.2 16SrRNA甲基化酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果

56株產(chǎn)ESBLs革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA 基因擴(kuò)增均為陰性，其PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

表1 PCR引物序列

圖1 TEM基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 16SrRNA甲基化酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，昆明地區(qū)產(chǎn)ESBLs的耐藥菌株有較高的檢出率［2］。本研究通過(guò)表型確證試驗(yàn)確證的56株產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌均檢測(cè)出TEM型β－內(nèi)酰胺酶基因。目前已發(fā)現(xiàn)了160種TEM型衍生酶，其中大部分是 ESBLs［3－5］。本研究中的產(chǎn) ESBLs菌株具體為何種TEM亞型尚待測(cè)序分析。

產(chǎn)ESBLs的菌株表現(xiàn)為多重耐藥，常常對(duì)臨床所用的氨基糖苷類藥物同時(shí)耐藥。普遍認(rèn)為細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥的主要機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生了可以水解氨基糖苷類藥物的酶，但這些水解酶不能水解所有的氨基糖苷類藥物，如阿貝卡星。近年研究發(fā)現(xiàn)，一類由質(zhì)粒介導(dǎo)的16SrRNA甲基化酶能使藥物作用靶位16SrRNA G1405上的N-7位鳥苷變?yōu)?－甲基鳥苷或?qū)1408上的腺嘌呤N-1位甲基化，致使細(xì)菌的30S核糖體16SrRNA與氨基糖苷類藥物的親和力下降，從而出現(xiàn)對(duì)氨基糖苷類藥物的高水平耐藥，其 MIC值往往高達(dá)512－1024μg／ml［6－10］，因此，產(chǎn)16SrRNA 甲基化酶可使細(xì)菌泛氨基糖苷類耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)16SrRNA甲基化酶基因與β－內(nèi)酰胺酶基因存在連鎖關(guān)系，常與碳青霉烯酶或者ESBLs編碼基因連鎖傳播［11］，通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)，以轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合、傳遞等方式在同種或不同種屬菌株間轉(zhuǎn)移和傳播，造成院內(nèi)感染流行，對(duì)氨基糖苷類和β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的臨床應(yīng)用產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。

到目前為止，在革蘭陰性桿菌中已發(fā)現(xiàn)armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA 6種16SrRNA甲基化酶基因。在一些歐美國(guó)家都有質(zhì)粒介導(dǎo)16S rRNA甲基化酶臨床分離株引起感染的報(bào)道［6，8，12－14］。研 究 表 明，北 美 洲 主 要 以 armA 和rmtB為主，歐洲以armA為主，拉丁美洲以rmtD為主［14］，不同地區(qū)16SrRNA甲基化酶的流行率和流行基因型存在差別。2004年中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)分離的肺炎克雷伯菌armA和rmtB的陽(yáng)性率分別為0.4%和0.04%［8］。國(guó)內(nèi)不同地區(qū)醫(yī)院16SrRNA甲基化酶基因檢出率也各有不同，杭州沈曉強(qiáng)等報(bào)道在6省市臨床分離的447株產(chǎn)ESBLs的菌株中篩選到1株產(chǎn)armA型16SrRNA甲基化酶的產(chǎn)酸克雷伯菌，吳蓉等報(bào)道在上海普陀醫(yī)院臨床分離的53株對(duì)慶大霉素和／或阿米卡星耐藥的革蘭陰性桿菌中篩選出10株產(chǎn)16SrRNA甲基化酶的菌株［1，11］。

本院近年來(lái)革蘭陰性桿菌對(duì)慶大霉素的耐藥率持續(xù)在50%－60%，對(duì)阿米卡星的耐藥率則維持在8%－10%，監(jiān)測(cè)我院16SrRNA甲基化酶基因的攜帶情況對(duì)臨床有重要意義。本研究結(jié)果顯示56株產(chǎn)ESBLs革蘭陰性腸桿菌均未檢出16SrRNA甲基化酶基因，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果存在差別［1，11］，導(dǎo)致菌株耐藥基因攜帶率不同的原因可能與菌株來(lái)源（地理位置）和各地區(qū)醫(yī)院抗菌藥物的使用習(xí)慣不同有關(guān)，也與本研究的樣本僅限于產(chǎn)ESBLs革蘭陰性腸桿菌科細(xì)菌有關(guān)。雖然如此，仍應(yīng)重視對(duì)該耐藥基因的早期篩查和監(jiān)控，本課題組也將擴(kuò)大樣本范圍及樣本量繼續(xù)追蹤調(diào)查本地區(qū)耐藥基因的流行情況。

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1007－4287（2012）10－1910－03

2011－03－07）