劉淑文，郭忠輝，劉 蕾，宮立程，楊 光，楊 軍＊

（1.吉林省人口生命科學(xué)技術(shù)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 手外科）

一個(gè)獨(dú)特臨床表型的SPD家系HOXD13基因突變分析

劉淑文1，郭忠輝1，劉 蕾1，宮立程2，楊 光2，楊 軍2＊

（1.吉林省人口生命科學(xué)技術(shù)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 手外科）

＊通訊作者

先天性并指（趾）多指（趾）畸形（synpolydactyly，SPD）為Ⅱ型并指，典型的表現(xiàn)為手部3、4指并指和（或）足部4、5趾并趾，并伴有多指（趾）［1］。目前認(rèn)為非綜合征的SPD為常染色體顯性遺傳疾病，位于2q31的H0XD13基因是其致病基因。我們收集到一個(gè)3代的SPD家系，其中3例患者表現(xiàn)為三種變異的并指多指畸形。對(duì)該家系HOXD13基因突變的研究發(fā)現(xiàn)，此家系中患者均攜帶發(fā)生9個(gè)丙氨酸延展突變的HOXD13基因。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象一個(gè)位于中國(guó)吉林省內(nèi)連續(xù)3代發(fā)生SPD的家系（圖1）。先證者Ⅲ1就診于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手外科門(mén)診，我們通過(guò)先證者父母進(jìn)行臨床及遺傳資料收集整理。該家系共3代6名成員，其中患者3人，均為男性患者，跨越3代并無(wú)隔代遺傳現(xiàn)象，符合常染色體顯性遺傳病特征。我們對(duì)3例患者進(jìn)行了臨床診斷，并拍攝了數(shù)碼照片和X線片（圖2）。

患者Ⅰ1（A、A′、B、B′）根據(jù)數(shù)碼照片和線片可以看出表現(xiàn)為輕微的臨床表型。Ⅱ1（C、C′、D、D′）表現(xiàn)為雙手的屈指畸形和關(guān)節(jié)粘連。Ⅲ1（先證者，E、E′、F、F′）數(shù)碼照片為兩次手術(shù)后，X線片為未手術(shù)前原始照片，表現(xiàn)為獨(dú)特的復(fù)指、橫向指骨及掌指骨融合

圖1 SPD家系圖

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 經(jīng)患者及家屬知情同意后，采集家系成員外周血6份（10ml／人），同時(shí)抽取100名無(wú)關(guān)志愿者靜脈血液進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，其中男57名，女43名。之后采用TIANamp Blood DNA Kit提取基因組DNA，記錄DNA濃度后，EP管密封－4℃保存?zhèn)溆谩ＴO(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HOXD13基因外顯子1和2。擴(kuò)增步驟為：預(yù)變性溫度為94度3分鐘，94度55秒，64度55秒，72度60秒，35個(gè)循環(huán)，最后延伸為72度10分鐘。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴乙錠染色后觀察條帶。

1.2.2 測(cè)序 使用相同的引物，測(cè)序儀器為ABI PRISM 3730，測(cè)序試劑為BigDye terminator v3.1，由北京華大基因生物公司測(cè)序部對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化及測(cè)序。將突變片段的測(cè)序結(jié)果與Genebank中HOXD13第1，2外顯子中該DNA序列進(jìn)行比較。

圖2 SPD家系雙側(cè)手足外形和X線片

2 結(jié)果

2.1 臨床特征該家系患者臨床表型為一個(gè)較寬泛的SPD表型譜。其中患者I1為較輕微的臨床表型，僅表現(xiàn)為左中、環(huán)指并指，伴有環(huán)指短指、小指屈曲畸形，X線片見(jiàn)環(huán)指近節(jié)、中節(jié)指骨發(fā)育畸形，且近位指間關(guān)節(jié)發(fā)育異常。右中、環(huán)指遠(yuǎn)節(jié)指骨輕度橈側(cè)偏斜。左足表現(xiàn)為第4、5足趾軟組織并指，右足未見(jiàn)異常。

患者Ⅱ1臨床表型較I1嚴(yán)重，雙手及雙腳均見(jiàn)異常。左2～5指屈曲畸形，且示指橈偏，中、環(huán)、小指尺偏，X線片環(huán)指掌指關(guān)節(jié)處見(jiàn)異常骨塊。右手較左手不同之處在于右手中、環(huán)指并指?；颊唠p足第4、5足趾并趾。

Ⅲ1（先證者）雙手曾進(jìn)行過(guò)兩次手術(shù)。左手畸形重于右手，中、環(huán)、小指并指，伴環(huán)指短指、橈偏畸形、小指屈曲畸形。X線片可見(jiàn)異常發(fā)育指骨、橫向指骨及掌指骨融合。右手表現(xiàn)為中、環(huán)指并指畸形。雙足第4、5足趾并指多指。

2.2 HOXD13突變分析

我們用PCR和擴(kuò)增PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，分析家系中3個(gè)患者、3個(gè)正常個(gè)體及100個(gè)對(duì)照個(gè)體基因型，發(fā)現(xiàn)該家系中3名患者HOXD13基因第1外顯子中存在重復(fù)突變（c.186-212dup），此突變導(dǎo)致HOXD13蛋白氮端結(jié)構(gòu)域多聚丙氨酸鏈延長(zhǎng)9個(gè)丙氨酸（圖3），而在家系中正常個(gè)體及100名對(duì)照無(wú)關(guān)志愿者中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異常。

圖3 反向引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖

3 討論

先天性并指畸形（Syndactyly）是人類(lèi)最常見(jiàn)的肢端畸形之一，發(fā)生率為1：2000～1：2500，特征表現(xiàn)為兩個(gè)或兩個(gè)以上手指及其相關(guān)組織成分先天性病理相連［2］。1978年 Tentamy和 McKusick［3］將并指畸形分為五種類(lèi)型，其中Ⅱ型為并指（趾）多指（趾）畸形（SPD）。根據(jù)臨床表型的不同，SPD可分為典型表型、輕微表型和特殊表型［4］；而遺傳學(xué)上將SPD分為SPD1、SPD2和SPD3三種類(lèi)型，分別定位于2q31，22q13.31 和 14q11.2－q12［3］。

HOX基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子超家族，在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。HOX基因包括HOXA、HOXB、HOXC、HOXD4個(gè)基因簇，分別位于 不 同 的 染 色 體 上［5、6］，其 中 HOXD 位 于 2q31。HOXD13位于HOXD簇最5′端，有兩個(gè)外顯子，其中外顯子1包含一個(gè)不完全的三核苷酸重復(fù)序列，編碼一個(gè)由15個(gè)丙氨酸殘基組成的多聚丙氨酸片段［7］。目前研究發(fā)現(xiàn)HOXD13的7～14個(gè)多聚丙氨酸鏈延展突變可導(dǎo)致具有典型臨床表現(xiàn)的SPD1，而少于6個(gè)丙氨酸插入不能引起表型異常［8］。我們報(bào)道的這個(gè)家系中3名患者HOXD13基因第1外顯子中存在重復(fù)突變，此突變導(dǎo)致HOXD13蛋白氮端結(jié)構(gòu)域多聚丙氨酸鏈延長(zhǎng)9個(gè)丙氨酸，這和以往的研究一致。

對(duì)于SPD1的臨床表型與多聚丙氨酸鏈延伸的長(zhǎng)度是否相關(guān)存在爭(zhēng)議。Goodman等［9］搜集了20個(gè)聚丙氨酸延展突變的SPD家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)突變基因在逐代傳遞過(guò)程中，家系內(nèi)部多聚丙氨酸鏈長(zhǎng)度雖然沒(méi)有發(fā)生改變，但是在家系之間進(jìn)行比較時(shí)，SPD表型的嚴(yán)重程度和外顯率隨著多聚丙氨酸鏈長(zhǎng)度增加而明顯增加。其中一個(gè)插入14個(gè)丙氨酸家系的患者都表現(xiàn)為嚴(yán)重的表型，手部畸形均累計(jì)指骨和腕部，男性患者中還出現(xiàn)了尿道下裂。2004年Albrecht等［10］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PAE突變型HOXD13蛋白不能進(jìn)入核內(nèi)，而野生型蛋白可以順利進(jìn)入核內(nèi)行使功能，據(jù)此推斷隨著插入丙氨酸鏈長(zhǎng)度的增加，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響也增大，阻礙其行使正常的功能，能夠說(shuō)明SPD獨(dú)特的臨床與遺傳異質(zhì)性。但是近年另一個(gè)對(duì)32個(gè)SPD1家系的調(diào)查研究表明SPD1基因型與表現(xiàn)型之間無(wú)明顯相關(guān)性［4］。

我們報(bào)道的這個(gè)HOXD13基因9個(gè)丙氨酸延展突變的家系患者表現(xiàn)為輕重不等的臨床表型。其中先證者Ⅲ1為特殊表型，表現(xiàn)為獨(dú)特的復(fù)指、橫向指骨及掌指骨融合，此之前的文獻(xiàn)中未見(jiàn)描述，其意義在于增加了HOXD13多聚丙氨酸延展突變可能引起的表型范圍，但尚需進(jìn)一步的研究探索此種變異的機(jī)制，解釋引起此表型異質(zhì)性的原因。

［1］Goodman FR.Limb malformations and the human HOX genes［J］.Am J Med Genet，2002，112（3）：256.

［2］洪光祥，王 煒.手部先天性畸形［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004.67.

［3］Tentamy SA，McKusick VA.The Genetics of Hand Malformations.Birth Defects［J］.Orig Artic Ser，1978，14（3）：1.

［4］Malik S，Grzeschik KH.Synpolydactyly：clinical and molecular advances［J］.Clin Genet，2008，73（2）：113.

［5］Scott MP.Vertebrate homeobox gene nomenclature［J］.Cell，1992，71（4）：551.

［6］Kosaki K，Kosaki R，Suzuki T，et al.Complete mutation analysis panel of the 39human HOX genes［J］.Teratology，2002，65（2）：50.

［7］Akarsu AN，Stoilov I，Yilmaz E，et al.Genomic structure of HOXD13gene：a nine polyalanine duplication causes synpolydactyly in two unrelated families［J］.Hum Mol Genet，1996，5（7）：945.

［8］Malik S，Girisha KM，Wajid M，et al.Synpolydactyly and HOXD13polyalanine repeat：addition of 2alanine residues is without clinical consequences［J］.BMC Med Genet，2007，11（8）：78.

［9］Goodman FR，Mundlos S，Muragaki Y，et al.Synpolydactyly phenotypes correlate with size of expansions in HOXD13polyalanine tract［J］.Proc Natl Acad Sci，1997，94（14）：7458.

［10］Albrecht AN，Kornak U，Boddrich A，et al.A molecular pathogenesis for transcription factor associated poly-alanine tract expansions［J］.Hum Mol Genet，2004，13（20）：2351.

1007－4287（2012）10－1863－03

吉林省財(cái)政廳科研項(xiàng)目基金（編號(hào)2060302）

2011－08－17）