呂曉紅，李 丹，袁海波，華樹成

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

影響呼出氣冷凝液pH值、一氧化氮、過氧化氫測(cè)定因素的探討

呂曉紅，李 丹，袁海波，華樹成＊

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

目的 探討呼出氣冷凝液（EBC）收集方式，EBC保存時(shí)間與吸煙等對(duì)EBC內(nèi)pH值、一氧化氮（NO）、過氧化氫（H2O2）測(cè)定結(jié)果的影響，從而確定EBC收集的條件，提高EBC內(nèi)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。方法應(yīng)用自行研制的EBC收集器對(duì)20名健康受試者進(jìn)行EBC的收集。收集的受試者分別采用不同呼吸方式、不同冷卻溫度、不同通氣管等進(jìn)行樣本收集。EBC的pH值測(cè)定應(yīng)用pH儀，NO和H2O2測(cè)定分別采用化學(xué)分析法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果pH值檢測(cè)主要受到EBC采集時(shí)呼吸方式的影響，NO檢測(cè)受到EBC采集時(shí)呼吸方式、EBC收集器通氣管道，EBC保存時(shí)間的影響，H2O2檢測(cè)受到EBC采集時(shí)呼吸方式、冷卻溫度、EBC收集器通氣管道、EBC保存時(shí)間的影響。受試者自身生理?xiàng)l件以及吸煙等因素對(duì)于pH值、NO、H2O2檢測(cè)沒有明顯影響。結(jié)論進(jìn)行EBC內(nèi)pH值、H2O2、NO檢測(cè)時(shí)應(yīng)充分考慮EBC收集方式以及EBC保存時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，從而提高檢測(cè)的真實(shí)性。

呼出氣冷凝液；pH值；一氧化氮；過氧化氫

（ChinJLabDiagn，2012，16：1833）

呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）檢測(cè)是近年來新出現(xiàn)的檢測(cè)呼吸道疾病炎癥狀態(tài)的無創(chuàng)檢測(cè)手段，具有簡(jiǎn)便、易行、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，分析EBC內(nèi)的物質(zhì)可以評(píng)價(jià)肺部疾病的病理生理學(xué)變化情況，為監(jiān)測(cè)肺部疾病的進(jìn)展和治療效果提供了新途徑［1，2］。

pH值、一氧化氮（nitric oxide，NO），過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）是反映呼吸道炎癥與氧化應(yīng)激的重要分子，這些分子檢測(cè)的準(zhǔn)確性對(duì)于臨床病情的判定尤為重要［3，4］。本研究擬在利用自行制備的EBC收集器進(jìn)行EBC收集基礎(chǔ)上，對(duì)EBC收集時(shí)呼吸方式、冷卻溫度、EBC收集器通氣管道、EBC保存時(shí)間、受試者自身生理?xiàng)l件以及吸煙等因素對(duì)pH值、NO、H2O2檢測(cè)的影響進(jìn)行初步探討，旨在確定EBC收集的最佳方案，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取吉林大學(xué)第一醫(yī)院護(hù)士、醫(yī)生與健康志愿者共20人，均無任何疾病，男性7人，女性13人，年齡25～65歲，平均年齡為45歲，吸煙者10例，不吸煙者10例。肺功能檢查結(jié)果：FEV1／預(yù)計(jì)值%為103.1% ±18.99%，潮氣量為0.44±0.08L，每分通氣量17.305±14.566L／min。所應(yīng)用肺功能儀：購(gòu)自美國(guó)森迪斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：622D。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組分別檢測(cè)不同的呼吸方式（鼻式吸氣與口式吸氣）、冷卻溫度、收集通氣管（彎管與直管）、保存時(shí)間下EBC內(nèi)pH值、H2O2、NO，分別評(píng)價(jià)這些因素對(duì)EBC物質(zhì)檢測(cè)的影響。

1.3 EBC收集方法應(yīng)用自制EBC收集器［5］（已申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)?00810050485.X）進(jìn)行EBC收集。方法如下：受試者休息15min，漱口，帶或不帶鼻夾，去枕、仰臥位（根據(jù)病人情況，不能平臥者取坐位）平靜呼吸10-15min，收集過程中有唾液囑患者咽下，如咳嗽囑其暫停收集。收集完畢后測(cè)量EBC的量并分裝在－80℃冰箱保存。每次收集后取樣管用去離子水沖洗3遍烤干待用。阻唾液套管及其與取樣管連接的硅膠管用去離子水沖洗3遍晾干待用。收集時(shí)間均選擇上午10點(diǎn)。采集中隨時(shí)觀察有無胸悶、氣短、意識(shí)改變及其他不良反應(yīng)，并及時(shí)處理；采集時(shí)室溫為19～21℃，濕度為48%～49%。

1.4 EBC的pH值、NO、H2O2的檢測(cè)

1.4.1 將收集的EBC利用pH計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 EBC的NO的檢測(cè) 應(yīng)用經(jīng)典的Griess化學(xué)分析法進(jìn)行檢測(cè)，采用碧云天生物技術(shù)公司的一氧化氮檢測(cè)試劑盒，主要過程按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.4.3 EBC的H2O2的檢測(cè) H2O2的檢測(cè)應(yīng)用化學(xué)分析法進(jìn)行檢測(cè)，采用碧云天生物技術(shù)公司的過氧化氫檢測(cè)試劑盒，主要過程按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理利用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩組之間的t檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)值用±S表示，P＜0.05為顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同呼吸方式對(duì)EBC內(nèi)pH值、H2O2、NO檢測(cè)的影響在利用通氣管為彎管，冷卻溫度為－15℃，收集時(shí)間為15min的收集條件下，分別采用鼻式吸氣和口式吸氣進(jìn)行EBC收集并檢測(cè)。結(jié)果表明：鼻式吸氣與口式吸氣收集EBC內(nèi)的pH值、H2O2、NO均有明顯差異（P＜0.05）（表1）。

2.2 不同冷卻溫度對(duì)EBC內(nèi)pH值、H2O2、NO檢測(cè)影響采用口吸、彎管、冷卻溫度分別為－15℃、－10℃、－5℃，收集EBC 10min并檢測(cè) 結(jié)果表明：EBC內(nèi)pH值、NO在不同冷卻溫度沒有差異（P＞0.05）；H2O2隨著溫度升高檢測(cè)濃度減少，有明顯差異（P＜0.05）。（表1）

表1 不同收集條件下各影響因素對(duì)EBC的PH、H2O2、NO檢測(cè)的影響

2.3 不同的收集通氣管對(duì)pH值、H2O2、NO檢測(cè)影響采用口吸、冷卻溫度為－15℃，收集時(shí)間為10 min，分別采用彎管和直管收集EBC并檢測(cè)。結(jié)果表明：在直管與彎管收集EBC內(nèi)的pH值無差異；直管與彎管收集EBC內(nèi)的H2O2和NO水平存在顯著性差異（表1）

2.4 EBC的不同保存時(shí)間對(duì)pH值、H2O2、NO檢測(cè)影響采用口吸、彎管、冷卻溫度為－15℃，收集EBC 10min，分別-80℃保存24h、48h后檢測(cè)。結(jié)果表明：pH值并沒有隨EBC保存的時(shí)間而變化（P＞0.05）；H2O2和NO檢測(cè)濃度隨EBC保存的時(shí)間延長(zhǎng)有所下降，具有明顯性差異（P＜0.05）。（見表1）

2.5 年齡、身高、體重等生理指標(biāo)對(duì)EBC內(nèi)PH值、H2O2、NO測(cè)定的影響采用口吸、彎管、冷卻溫度為－15℃，收集EBC 10min，檢測(cè)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：年齡、身高、體重等生理指標(biāo)與EBC內(nèi)pH值、H2O2、NO檢測(cè)結(jié)果沒有相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r很小，在0～0.286之間）。

2.6 吸煙對(duì)EBC pH值、H2O2、NO測(cè)定的影響對(duì)吸煙與未吸煙的受試者采用口吸 、彎管、冷卻溫度為－5℃，收集EBC 10min并的檢測(cè)。結(jié)果表明：pH值在兩者之間沒有變化，H2O2、NO在吸煙者比未吸煙者高，但兩者相比沒有顯著差異。（見表1）

3 討論

EBC檢測(cè)在呼吸系統(tǒng)疾病診斷與治療方面的應(yīng)用研究越來越得到重視，但EBC內(nèi)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果易受到多種因素的影響，如EBC收集方式（包括呼吸方式、冷卻溫度、收集器通氣管）、EBC保存時(shí)間、受試者自身生理?xiàng)l件以及吸煙等，從而影響疾病判定的準(zhǔn)確性與可行性。

本研究通過對(duì)上述因素進(jìn)行逐一檢測(cè)分析，結(jié)果顯示呼吸方式對(duì)pH值、H2O2、NO測(cè)定有明顯影響，考慮到鼻式吸氣可能的污染，所以EBC的收集應(yīng)采用用口吸氣用口呼氣方式。

在收集通氣管的選擇上，直管與彎管收集EBC的pH值無差異，但收集EBC的H2O2和NO水平存在顯著性差異，所以在進(jìn)行EBC收集時(shí)應(yīng)采用阻唾液管（彎管），防止唾液的污染對(duì)檢測(cè)物質(zhì)的影響。

有研究表明EBC冷卻溫度對(duì)于一些物質(zhì)的檢測(cè)具有影響［6］。本研究結(jié)果表明：EBC內(nèi)的pH值、NO不受溫度的影響，但H2O2隨著溫度升高檢測(cè)濃度減少，說明H2O2的檢測(cè)受到EBC冷卻溫度的影響，所以在檢測(cè)這類物質(zhì)時(shí)應(yīng)注意冷卻溫度。

EBC內(nèi)一些物質(zhì)很不穩(wěn)定，所以長(zhǎng)時(shí)間的保存可能對(duì)EBC檢測(cè)有影響。本研究結(jié)果表明：ECG內(nèi)pH值并沒有隨保存的時(shí)間而變化，而H2O2和NO檢測(cè)濃度隨EBC保存的時(shí)間有所下降。所以，對(duì)于H2O2、NO等不穩(wěn)定的物質(zhì)，應(yīng)該盡早檢測(cè)，不宜保存時(shí)間過長(zhǎng)。

有研究表明［7］年齡對(duì)EBC內(nèi)H2O2的檢測(cè)有一定的影響，但本研究沒有發(fā)現(xiàn)任何生理指標(biāo)與pH值、H2O2、NO測(cè)定結(jié)果有相關(guān)性。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道并不相同，考慮原因有兩方面，一是樣本量較少，二是考慮EBC收集和測(cè)量的方法不同?？傊?，在進(jìn)行疾病研究時(shí)，應(yīng)盡量選擇生理指標(biāo)相近的樣本作為對(duì)照，盡量減少由于生理指標(biāo)對(duì)于檢測(cè)帶來的差異。

吸煙將會(huì)提高正常人與呼吸疾病患者EBC內(nèi)某些物質(zhì)濃度，如H2O2、8-異前列素、硝基酪氨酸、細(xì)胞因子等［8，9］。但本研究結(jié)果顯示EGC內(nèi)pH、H2O2、NO在吸煙者與未吸煙相比沒有顯著差異。與文獻(xiàn)報(bào)道不同的原因可能為：（1）吸煙的方式對(duì)物質(zhì)測(cè)定的影響，有研究表明急性吸煙與慢性吸煙對(duì)EBC物質(zhì)檢測(cè)的影響不同，本研究并沒有注意這一點(diǎn)；（2）在吸煙患者測(cè)定EBC的H2O2、NO結(jié)果的變異系數(shù)較大，對(duì)比較結(jié)果有一定影響，所以需要進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行研究。

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Study on the effects of pH value、nitric oxide、hydrogen peroxide in EBC

LVXiao-hong，LIDan，YUANHai-bo，etal.（DepartmentofRespiratoryDisease，TheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the effects of the method for exhaled breath condensate（EBC）collection，EBC preservation time and smoking on pH value，nitric oxide（NO），hydrogen peroxide（H2O2）in EBC，determine the appropriate conditions for collection of EBC，and improve the accuracy of test results for the material in EBC.MethodsEBC collection was completed on 20healthy subjects by EBC collector developed by our lab.The samples were collected by different breathing patterns，at different collection temperature，and by different snorkel，etc.PH value of EBC was determined by pH apparatus，the levels of NO and H2O2were determined by chemical analysis method.ResultspH value was mainly affected by breathing pattern when EBC was collected；The level of NO was affected by breathing pattern，EBC collector ventilation pipe and EBC preservation time；The level of H2O2was affected by breathing pattern，temperature when collected，EBC collector ventilation pipe and EBC preservation time.No significant effects of the physical conditions and smoking were found on the above parameters.ConclusionThe method for EBC collection and EBC preservation time should be taken into consideration to improve the accuracy of the results when pH value，the levels of H2O2and NO was detected in EBC.

exhaled breath condensate；pH value；nitric oxide；hydrogen peroxide

R446.19

A

1007－4287（2012）10－1833－03

吉林省科技廳基金資助課題（20060582）

＊通訊作者

呂曉紅（1973-），女，吉林省長(zhǎng)春市人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事呼吸系統(tǒng)感染性疾病的研究；華樹成，教授，博士生導(dǎo)師，吉林大學(xué)第一醫(yī)院副院長(zhǎng)，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病診治。

2011－08－15）