Aadil Yousif，牛 超，李 薇，蒿姍姍，徐效義，崔久嵬

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春 130021）

三氧化二砷聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞株凋亡及相關(guān)機(jī)制的研究

Aadil Yousif，牛 超，李 薇，蒿姍姍，徐效義，崔久嵬＊

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春 130021）

目的 本研究旨在探討三氧化二砷與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用對多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法CCK-8法檢測三氧化二砷與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用對RPMI8226細(xì)胞增殖的抑制作用；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種藥物誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡情況及各藥物組處理前后的細(xì)胞表面死亡受體4（death receptor 4，DR4）和死亡受體5（death receptor 5，DR5）表達(dá)的變化；Western blot檢測各藥物組Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果三氧化二砷與硼替佐米聯(lián)合組對RPMI8226細(xì)胞生長抑制明顯高于三氧化二砷單藥組，細(xì)胞凋亡率均較三氧化二砷單藥組明顯增多，細(xì)胞表面DR4和DR5表達(dá)明顯增高。與三氧化二砷或硼替佐咪單藥組相比較，聯(lián)合用藥組RPMI8226細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下調(diào)明顯，而caspase-3，caspase-8和caspase-9表達(dá)上調(diào)明顯。結(jié)論硼替佐米可以增加RPMI8226細(xì)胞對三氧化二砷誘導(dǎo)凋亡的敏感性，這可能與Bcl-2的表達(dá)下調(diào)及caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP蛋白的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

多發(fā)性骨髓瘤；硼替佐米；三氧化二砷；協(xié)同作用

（ChinJLabDiagn，2012，16：1801）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是最為常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年來，一些新型的分子靶向藥物，例如硼替佐米（bortezomib，BZ），明顯提高了MM的緩解率，但其治療仍存在復(fù)發(fā)和耐藥的問題。雖然三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）為復(fù)發(fā)難治多發(fā)性骨髓瘤的提供了一種新的治療手段，但目前臨床試驗(yàn)顯示，單用ATO仍有55%-80%患 者治療無效［1］。本 研 究 基 于 BZ 和ATO具有不同的作用機(jī)制，選用MM細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞為研究對象。通過研究BZ與ATO聯(lián)合作用于RPMI8226細(xì)胞的效果，探討B(tài)Z是否能夠增強(qiáng)RPMI8226細(xì)胞對ATO凋亡的敏感性，并對其機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床上治療多發(fā)性骨髓瘤提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞株購于美國ATCC；RPMI-1640、胎牛血清和PBS（Gibco公司）；硼替佐米（西安楊森公司）；三氧化二砷即亞砷酸氯化鈉注射液（哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)公司）；6孔及96孔板培養(yǎng)板（Coring公司）；CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（武漢博士德）；Annexin V-FITC／PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（Bender公司）；Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP 單 抗、β-actin、DR4、DR5鼠抗人一抗多克隆抗體（Santa Cruz公司）；兔抗鼠二抗多克隆抗體（中杉金橋）；Western blot試劑盒（KPL公司）；FACScan型流式細(xì)胞儀（BD公司）；酶標(biāo)儀（BIO-TEK公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞株懸浮培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（內(nèi)含2mmol／L谷氨酰胺）中，置于5%CO2飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每48h傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測BZ聯(lián)合ATO后細(xì)胞生長情況 收集對數(shù)生長期的RPMI8226細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)／ml，接種于96孔板，100μl／孔。結(jié)合參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BZ和ATO分別選取終濃度為20nmol／L及2μmol／L、5μmol／L。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組為：單藥BZ（20nmol／L）處理組；單藥ATO（0、2μmol／L 和 5μmol／L）處 理 組；BZ（20 nmol／L）聯(lián)合 ATO（2μmol／L、5μmol／L）處理組；對照組（加同體積PBS）。于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl CCK-8，5%CO2飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后，利用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔在490nm下的吸光度（OD）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)金（正均）式公式來判定兩種藥物之間的相互作用。

Q＝E（a＋b）／（Ea＋Eb-Ea×Eb），式中Ea為ATO單藥組的細(xì)胞抑制率，Eb為BZ單藥組的細(xì)胞抑制率，E（a＋b）為聯(lián)合用藥組的細(xì)胞抑制率。當(dāng)Q＜0.85時(shí)，兩種藥物為拮抗作用；當(dāng)0.85≤Q＜1.15時(shí)，兩種藥物為單純相加，當(dāng)1.15≤Q時(shí)，兩種藥物為協(xié)同作用。

1.2.3 流式細(xì)胞儀 Annexin V-FITC／PI染色法檢測細(xì)胞周期及凋亡情況 收集對數(shù)生長期的RPMI8226細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)／ml，接種于6孔板，3ml／孔。實(shí)驗(yàn)分為ATO單藥組（終濃度為5.0μmol／L）、BZ單藥組（終濃度為20nmol／L）、兩藥聯(lián)合組以及對照組（加同體積的PBS），培養(yǎng)48h后收集各組細(xì)胞。按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書以Annexin V-FITC及PI標(biāo)記細(xì)胞，于1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測兩種藥物聯(lián)合后細(xì)胞表面DR4和DR5的表達(dá)情況 收集對數(shù)生長期的RPMI8226細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)／ml，分為ATO單藥組（終濃度為5.0μmol／L）、BZ單藥組（終濃度為20nmol／L）、兩藥聯(lián)合組以及對照組（加入同體積PBS），培養(yǎng)48h后收集各組細(xì)胞。加入鼠抗人DR4和DR5單克隆抗體工作液各100 μl，充分混勻后，4℃孵育30min。PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的二抗，混勻后，4℃避光孵育30min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot 檢 測 藥 物 作 用 后 Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9及 PARP 蛋白 水 平檢測 收集各組藥物作用后的RPMI8226細(xì)胞，加入預(yù)冷的PBS洗滌2遍，以1×107個(gè)／ml加入細(xì)胞裂解液（50mmol／L pH 8.0Tris-HCl，150mmol／L NaCl，1%Triton X-100，100μg／ml PMSF）置冰上30min后，13 000rpm，4℃離心20min，取上清，Bradford法測定蛋白濃度。蛋白樣品行12-15%的SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。含5%脫脂牛奶的 TBST封閉30min，分別用Bcl-2單抗、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及 PARP 抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min。二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10min，然后顯影曝光。以β-actin為內(nèi)參照，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以供分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件，組間比較用方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BZ聯(lián)合ATO作用后對細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)CCK-8檢測兩種藥物單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合應(yīng)用對RPMI8226細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著ATO藥物濃度的增加，其對RPMI8226細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)；20nmol／L的BZ分別聯(lián)合2 μmol／L和5μmol／L的ATO對RPMI8226細(xì)胞作用后，計(jì)算Q值分別為1.30和1.27，說明BZ聯(lián)合ATO作用于RPMI8226細(xì)胞，具有協(xié)同抑制作用（如圖1）。

2.2 BZ與ATO聯(lián)合對RPMI8226細(xì)胞凋亡的影響

分別對ATO單藥組、BZ單藥組、兩藥聯(lián)合組及對照組的細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行Annexin V和PI染色后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)行細(xì)胞凋亡情況檢測。如圖2所示：BZ單藥組、ATO單藥組及兩藥聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率分別為14.8%、16.3%及36.5%，與對照組（3.2%）相比，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 兩藥聯(lián)合對RPMI8226細(xì)胞表面DR4和DR5表達(dá)的影響

RPMI8226細(xì)胞經(jīng)單藥ATO、BZ以及兩藥聯(lián)合作用后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測對細(xì)胞表面DR4和DR5的表達(dá)的變化。如圖3所示：單藥組作用后，細(xì)胞表面DR4和DR5的表達(dá)均具有一定程度的升高，且兩藥聯(lián)合組升高的更為明顯，與對照組相比，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 ATO單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對RPMI8226細(xì)胞的生長抑制曲線

圖2 單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對RPMI8226細(xì)胞的凋亡影響

圖3 單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對RPMI8226細(xì)胞DR4和DR5表達(dá)的影響

2.4 BZ 聯(lián) 合 ATO 對 Bcl-2，caspase-3，caspase-8，caspase-9及PARP蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步研究BZ聯(lián)合ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖抑制作用的機(jī)制，我們檢測了細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的水平及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的caspase-3，caspase-8，caspase-9及 PARP蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示，單獨(dú)使用ATO或者單獨(dú)使用BZ均 能 夠 降 低 Bcl-2 的 表 達(dá)，并 使 caspase-3、caspase-8、caspase-9和 PARP 的表達(dá)增加，兩藥聯(lián)合后可使上述作用增強(qiáng)（如圖4）。

圖4 單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對Bcl-2，Caspase-3、8、9及PARP蛋白表達(dá)的影響

3 討論

迄今為止，多發(fā)性骨髓瘤仍是一種不可治愈性疾病，新的有效的治療方案是提高M(jìn)M緩解率和延長生存期的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示BZ具有增強(qiáng)ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞生長抑制生長和促進(jìn)凋亡的作用。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通過內(nèi)源性途徑和外源性途徑兩種，其中外源性（或死亡受體）途徑包括腫瘤壞死因子（TNF）家族受體和配體，激活caspase-8；內(nèi)源性途徑包括線粒體成分釋放調(diào)控的激活，活化caspase-9，兩條徐徑均通過激活caspase-3而誘導(dǎo)凋亡［2］。本實(shí)驗(yàn)中 BZ聯(lián)合 ATO 對細(xì)胞caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達(dá)較單用藥組均有明顯增強(qiáng)，提示二者聯(lián)合應(yīng)用是通過此作用來實(shí)現(xiàn)的。Caspase家族與Bcl-2被認(rèn)為是與細(xì)胞凋亡發(fā)生與調(diào)節(jié)密切相關(guān)［3］。本研究也檢測了Bcl-2的表達(dá)，顯示BZ與ATO具有協(xié)同降低bcl-2表達(dá)，提示其可能通過降低此抗凋亡蛋白的表達(dá)，而促進(jìn)內(nèi)源性凋亡途徑的激活。

為進(jìn)一步明確二者聯(lián)合應(yīng)用是如何增加caspase的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)對其上游調(diào)控因子進(jìn)行了研究。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是近年發(fā)現(xiàn)的TNF家族成員，其受體屬于TNF受體超家族［4，5］。多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)DR4和DR5并通過與配體TRAIL結(jié)合有效地激活外源性凋亡途徑，導(dǎo)致Caspase-8激 活，誘 導(dǎo) 凋 亡［6，7］。 本 研 究 結(jié) 果 顯 示，ATO、BZ均可誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡受體分子DR4、DR5表達(dá)上調(diào)，且二者具有協(xié)同作用。DR4、DR5表達(dá)與誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)，DR4和DR5表達(dá)上調(diào)可增加TRAIL與受體結(jié)合的概率，間接提高了TRAIL的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示BZ與ATO協(xié)同促凋亡作用部分是由此通路介導(dǎo)的。

綜上所述，BZ聯(lián)合ATO具有協(xié)同激活內(nèi)源性和外源性凋亡通路，抑制多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，兩者合用有可能為多發(fā)性骨髓瘤臨床治療開辟一條新途徑。

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［7］Abdulghani J，El-Deiry WS.TRAIL receptor signaling and therapeutics［J］.Expert Opinion on therapeutics，2010，14（10）：1091.

Apoptosis of RPMI8226cell induced by arsenic trioxide combined with bortezomib and its mechanism

AadilYousif，NIUChao，LIWei，etal.（CancerCenteroftheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China）

ObjectiveTo investigate the effects of arsenic trioxide and bortezomib on apoptosis of human multiple myeloma RPMI8226cells and its mechanism.MethodsCell proliferation was detected by CCK-8method to study the role of arsenic trioxide and bortezomib in RPMI 8226cells.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.The expression of cell surface death receptor 4（DR4）and death receptor 5（DR5）was also measured by flow cytometry.Western blot was applied to detecte the expression level of Bcl-2，caspase-3，caspase-8 ，caspase-9and PARP protein.ResultsThe group of arsenic trioxide combind with bortezomib showed more inhibitory effect on RPMI 8226cells than that of arsenic trioxide group.The apoptosis rate was significantly increased than arsenic trioxide group.The expression of DR4and DR5on the cell surface was significantly increased.Compared with arsenic trioxide group，the expression of Bcl-2was significantly decreased in the combined treatment group，while the expression of caspase-3，caspase-8，caspase-9and PARP were significantly increased.ConclusionIt is concluded that bortezomib can enhance sensitivity of RPMI8226to apoptosis by arsenic trioxide，which may be associated with decreasing the expression of Bcl-2and increasing the expression of caspase-3，caspase-8，caspase-9and PARP protein.

multiple myeloma；bortezomib；arsenic trioxide；apoptosis

R733.3

A

1007－4287（2012）10－1801－04

國家青年自然基金（30901702），吉林省中醫(yī)藥局項(xiàng)目（2010-pt057），吉林省中青年領(lǐng)軍人才創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（20111807），吉林大學(xué)杰出青年基金（201005001）

＊通訊作者

Aadil Yousif（1974-），男，在讀博士。

2012－05－24）