方中明，黃瑋婷，吳坤林，江 南，曾宋君*

(1．中國科學院華南植物園華南農(nóng)業(yè)植物遺傳育種重點實驗室，廣東廣州510650;2．中國科學院大學，北京100049;3．東莞市農(nóng)業(yè)科學研究中心，廣東東莞523000)

珍珠矮(Cymbidium．nanulum Y．S．Wu ＆ S．C．Chen)為蘭科蘭屬植物，屬于中國區(qū)域性特有的地生蘭，花期6月，花淡黃綠色或紫色，有香味，觀賞價值高［1-2］，野生資源已十分稀少．珍珠矮在自然條件下種子萌發(fā)率低，成苗難;人工栽培時主要靠分株繁殖，繁殖速度慢．珍珠矮的無菌播種和組織培養(yǎng)已有初步報道，但在根狀莖分化成芽的過程中，外植體易發(fā)生褐變，分化率較低［3-4］．植物組織培養(yǎng)中，常用的褐變抑制劑有活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、維生素C、二硫蘇糖醇、檸檬酸等［5-6］．作者已經(jīng)報道，培養(yǎng)基中添加檸檬酸能明顯減輕褐化，并提高根狀莖的出芽數(shù)［4］．本文研究在培養(yǎng)基中加入不同質量濃度的檸檬酸，觀察其對根狀莖分化和褐變的影響，測定與褐化相關的酶的活性和總酚含量，分析這些指標和褐化及根狀莖分化出芽的關系，為進一步開展珍珠矮及其它地生蘭的組織培養(yǎng)提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 材料

人工授粉后150 d的果實用體積分數(shù)為75%的酒精表面消毒30 s后，再以質量分數(shù)為0．1%的升汞溶液消毒15 min，無菌水沖洗4～5次．隨后將消毒的莢果置于滅菌的濾紙上吸干水分，用解剖刀切開莢果，將種子散落到種子萌發(fā)培養(yǎng)基1/2MS+10%的椰子汁+0．5 mg/L NAA+1 g/L活性炭的培養(yǎng)基上，4個月左右能形成根狀莖．根狀莖在1/2MS+6-BA 0．5 mg/L+NAA 2．0 mg/L+10% 的椰子汁+1 g/L活性炭培養(yǎng)上根狀莖能快速增殖．增殖所得到的根狀莖用于根狀莖分化和酶活性測定實驗．

1．2 根狀莖的分化

選取生長狀態(tài)相近的根狀莖，切割成長度為1．0 cm左右的切段，接種到添加不同質量濃度檸檬酸 (0、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0 g/L)的分化培養(yǎng)基(MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1mg/L+6．0 g/L瓊脂)上進行出芽誘導．每個處理10瓶，每瓶接種6個切段，重復3次．培養(yǎng)基的pH為5．4，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強度30～40 μmol/(m2·s)，光照12 h/d．根狀莖在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 d能分化出芽，分化效率采用出芽數(shù)表示(出芽數(shù)=總出芽個數(shù)/接種的根狀莖數(shù))．試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11．0軟件進行方差分析(ANOVA)，以Duncan’s新復極差在0．05水平上進行顯著性差異分析．

1．3 酶活性的測定方法

1．3．1 多酚氧化酶(PPO)活性測定 按朱廣廉［7］的方法進行，以每秒鐘A525的變化0．01為一個酶活性單位．

1．3．2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定 參照李合生［8］的方法，以A290變化0．01為一個酶活性單位．

1．3．3 過氧化物酶(POD)活性測定 用愈創(chuàng)木酚法［8］，以每分鐘 OD470變化0．01為一個活性單位．

1．3．4 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 用氮藍四唑(NBT)光還原法［8］測定，以抑制NBT光化還原50%的酶液量為一個酶活性單位．

1．3．5 過氧化氫酶(CAT)活性 用紫外分光光度法［9］，以每分鐘吸光度值的降低表示活性．

1．3．6 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu(福林酚)法［10］．

2 結果與分析

2．1 檸檬酸對珍珠矮根狀莖分化和褐變的影響

和未加入檸檬酸(對照)相比(表1)，在分化培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的檸檬酸，根狀莖的平均出芽數(shù)顯著增加，隨著檸檬酸質量濃度的升高，平均出芽數(shù)逐步升高，褐變程度變輕，當在培養(yǎng)基中添加1．0 g/L 檸檬酸時，平均出芽數(shù)最高，達到4．48，且生長良好，未見明顯褐化．當檸檬酸高于1．0 g/L時，隨著質量濃度的繼續(xù)增加，褐色程度變重，根狀莖平均出芽數(shù)下降，且生長狀況變差．

表1 檸檬酸對珍珠矮根狀莖的分化和褐變的影響Table 1 Effects of CA concentration in medium on differentiation and browning inhibition of rhizomes of Cymbidium nanulum

2．2 培養(yǎng)基中檸檬酸質量濃度對珍珠矮根狀莖中PPO、PAL、POD酶活性的影響

根狀莖在添加不同質量濃度檸檬酸的分化培養(yǎng)基(MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1 mg/L)上進行培養(yǎng)時，POD、PPO、PAL三者活性變化趨勢一致(圖1)．添加的檸檬酸在 0．1～1．0 g/L時，隨著添加的檸檬酸質量濃度的升高，珍珠矮根狀莖中PPO、PAL、POD酶活性開始下降，而當添加的檸檬酸高于1．0 g/L時，隨著質量濃度的繼續(xù)增加，這3種酶的活性升高．根狀莖中3種酶的活性均以1．0 g/L檸檬酸處理的最低，除PPO酶活性與添加2．0 g/L檸檬酸，與其它質量濃度相比，均表現(xiàn)出顯著性差異．

圖1 培養(yǎng)基中檸檬酸質量濃度對PPO、PAL、POD酶活性的影響Figure 1 Effects of CA concentration in medium on the activities of PPO，PAL and POD

2．3 培養(yǎng)基中檸檬酸對珍珠矮根狀莖中SOD、CAT酶活性的影響

圖2 培養(yǎng)基中檸檬酸質量濃度對SOD酶活性的影響Figure 2 Effects of CA concentration in medium on the activities of SOD

圖3 培養(yǎng)基中檸檬酸質量濃度對CAT酶活性的影響Figure 3 Effects of CA concentration in medium on the activities of CAT

根狀莖在添加不同質量濃度檸檬酸的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，SOD酶活性和CAT酶活性變化趨勢基本一致(圖2、圖3):檸檬酸在0．1～1．0 g/L范圍時，隨著檸檬酸質量濃度的升高，這2種酶的活性均上升，而當檸檬酸高于1．0 g/后時，這2種酶的活性逐漸下降．在所有處理中，SOD酶活性在檸檬酸含量為0．5、1．0、2．0 g/L 時，未表現(xiàn)出顯著性差異，在添加0．1或5．0 g/L檸檬酸，與未添加檸檬酸的對照相比也未表現(xiàn)出顯著性差異．而在培養(yǎng)基中加入不同質量濃度的檸檬酸時，CAT酶活性均高于對照，添加1．0 g/L檸檬酸時高于所有其它處理并表現(xiàn)出顯著性差異．

2．4 培養(yǎng)基中檸檬酸含量對珍珠矮根狀莖中總酚的影響

根狀莖在添加不同質量濃度檸檬酸的分化培養(yǎng)基 MS+NAA 0．5 mg/L+ 蔗糖 30．0 g/L+TDZ 0．1 mg/L中培養(yǎng)時，檸檬酸在0．1～1．0 g/L時，根狀莖總酚含量減低，檸檬酸為1．0 g/L時，總酚含量最低，顯著低于其它所有的處理．超過此質量濃度，隨著檸檬酸含量升高，總酚含量逐步升高，當檸檬酸為5．0 g/L時，總酚含量顯著高于對照(圖4)．

圖4 培養(yǎng)基中檸檬酸質量濃度對總酚含量的影響Figure 4 Effects of concentration of CA in medium on the total phenol content

3 討論

褐變是影響植物組織培養(yǎng)成功的重要因素．引起培養(yǎng)材料褐化的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等［11］．酚類物質是外植體中酶促褐變反應中的底物，總酚含量與褐化關系密切，是組織培養(yǎng)褐變的重要因素之一［12］;而PPO、POD和PAL氧化酚類物質產(chǎn)生的代謝物擴散到培養(yǎng)基中，就會抑制其它酶的活性，毒害外植體組織．因此PPO、POD、PAL活性以及總酚含量的變化與褐化程度密切相關［13］，可作為褐變程度的參考．國蘭等在離體培養(yǎng)時都有褐變現(xiàn)象出現(xiàn)．蝴蝶蘭外植體褐變過程與PAL基因表達相關［14］，PAL的合成及活性的增加，是褐變發(fā)生的前提［15］．

本試驗中，在培養(yǎng)基中添加0．1～1．0 g/L褐化抑制劑檸檬酸時，根狀莖平均出芽數(shù)增加，PPO、POD及PAL活性降低，同時總酚含量降低，當檸檬酸含量為1．0 g/L時，平均出芽數(shù)最高，酶活性及總酚含量達到最低，培養(yǎng)基褐化得到了有效的抑制，并且有利于根狀莖分化．而檸檬酸含量超過1．0 g/L時，PPO、POD、PAL活性反而升高，可能因為檸檬酸含量過高，使植物細胞滲透勢過大，對酶活性及褐化抑制效果都變差，本試驗中根狀莖的出芽數(shù)也顯示出下降的趨勢．檸檬酸是呼吸鏈中的一個抑制劑，在果實的褐變中作為抗褐變劑被使用．另外，由于檸檬酸鰲合酚類合成及氧化酶活性位點的Cu2+［16］，抑制了PPO等酶的活性，也影響材料褐變的程度．這與蝴蝶蘭［17］等中不同濃度檸檬酸處理在一定程度上抑制了褐化及相關酶活性的報道一致．外植體組織發(fā)生褐變時，膜脂過氧化加劇，導致膜透性增加，有關褐變發(fā)生的關鍵原因與細胞膜完整性被破壞．蝴蝶蘭外植體在褐變過程中，SOD和CAT活力均下降［17］．本試驗中，在添加不同質量濃度的檸檬酸后，SOD、CAT酶活性增高，說明組織細胞的膜脂過氧化減弱，褐化得到了較好控制．檸檬酸在1．0 g/L時對珍珠矮根狀莖分化出芽及控制褐化效果最好．

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