郭 磊，Mohammed Humayun KABIR，童建華，黃志剛，蕭浪濤

(湖南農業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，長沙410128)

脫落酸(ABA)參與了植物的種子萌發(fā)、氣孔運動、開花、結果和衰老等多個生長發(fā)育進程并在逆境應答系統(tǒng)中起著重要的作用［1-2］．很多ABA缺陷或抗性突變體種子不休眠或發(fā)生胎萌，多個ABA超敏感的擬南芥突變體種子休眠程度加強，表明ABA是一種重要的內源萌發(fā)抑制劑，許多種子成熟期間有2個ABA積累高峰期［1］．脫落酸在植物的逆境信號轉導系統(tǒng)中起著重要的作用［3］．水稻在水分脅迫狀態(tài)下，根源ABA是植物體內ABA的主要來源，可能是植物體在逆境情況下根系感受逆境信息而產生的一種向地上部傳遞的逆境信號［4］．因此，準確測定脫落酸的含量對于深入闡明脫落酸介導的發(fā)育過程和逆境應答等有關機制十分必要和迫切．

傳統(tǒng)植物激素檢測方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法和液相色譜-質譜聯(lián)用法等［5-7］．這些檢測方法通常是以植物組織為測定對象，但存在一定局限性．首先植物組織中的大量木質素、纖維素、蠟質、角質等成分，均是構成材料鮮重或干重的一部分，但在不同植物組織和器官中的含量不一致，以原生質體數(shù)量代替植物組織質量對植物激素進行衡量在統(tǒng)計方法上具有一定特色．其次，從植物組織中提取植物激素時需要較多的前處理步驟，不僅影響了測定的速度，且增加了潛在的誤差［8］．采用原生質體作為測定材料可以在一定程度上減少這些問題．利用纖維素酶、離析酶酶解細胞壁得到原生質體［9-10］，通過對原生質體的離心純化，已除去了不少影響植物激素檢測靈敏度的物質，用這種材料作為植物激素檢測的對象，可以降低誤差、提高植物激素測定的精確度和靈敏度．本文以原生質體為材料，研究了采用LC-MS法測定擬南芥原生質體的脫落酸，避免了細胞間隙中的復雜化學組成干擾，提高了植物激素測定的靈敏度和精度，完善了經典的植物激素測定技術．

1 材料與方法

1．1 試驗材料及培養(yǎng)

試驗材料:擬南芥(Arabidopsis thaliana L．)哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)．土培擬南芥的培養(yǎng)條件:擬南芥Col-0種子消毒、春化后，播種于混合土(m(營養(yǎng)土)∶m(蛭石)∶m(沙子)=1∶1∶1)中，生長 30 d 左右(光照周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度為22℃，濕度為70%)，取蓮座葉用于葉片原生質體的制備(圖1A)．液體MS培養(yǎng)擬南芥條件:擬南芥Col-0種子消毒、春化后，播種于MS固體培養(yǎng)基上(光照周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度為22℃，濕度為70%)，生長7 d后轉入MS液體培養(yǎng)基在搖床上(30 r/min)進行無菌培養(yǎng)8～10 d，取根系用于原生質體的制備(圖1B)．

1．2 試驗方法

1．2．1 主要儀器和試劑 主要儀器包括 Waters Acquity-SQD液質聯(lián)用儀，Olympus BX51熒光顯微鏡，Jouan RCT-60真空冷凍離心濃縮系統(tǒng)．主要有纖維素酶R-10、離析酶R-10(Yacult Honsha Co．，Tokyo，Japan)，ABA 標準品(HPLC 級，美國 SIGMA公司，純度大于98%)、乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)．

圖1 在液體MS培養(yǎng)基(A)和營養(yǎng)土(B)上培養(yǎng)得到的擬南芥Figure 1 Arabidopsis cultivated in solid MSmedium(A)，liquid MSmedium(B)and soil

1．2．2 擬南芥原生質體的制備 酶解液配方:1．5% 纖維素酶 R-10，0．4% 離析酶 R-10，20 mmol/L;KCl，20 mmol/L MES(pH 5．7)，0．1%BSA，0．4 mol/L 甘露醇，10 mmol/L CaCl2，0．45 μm濾膜過濾后，KOH校正pH為5．7．

WI溶液配方:0．5 mol/L 甘露醇，20 mmol/L KCl，4 mmol/L MES(pH 5．7)，0．45 μm 濾膜過濾后，KOH校正pH 為5．7．

葉片原生質體的制備:將葉片縱向切成1～2 mm寬的細條，置于酶解液中．25℃恒溫搖床上50 r/min游離4 h．酶解液通過74μm細胞篩網過濾后，將濾液4℃、60 r/min離心1 min，取沉淀懸浮于WI溶液中，重復洗滌3次，利用血球計數(shù)板計算原生質體數(shù)量，4℃ 100 r/min離心5 min后去掉上清，得到葉片原生質體樣品用于脫落酸的提取和測定．

根系原生質體的制備:將根系用手術剪縱向切碎，置于酶解液中，25℃恒溫搖床上50 r/min震蕩4 h，進行原生質體的游離．將酶解液通過74μm細胞篩網過濾后，將擬南芥根系原生質體濾液4℃、200 r/min離心1 min，取沉淀懸浮于WI溶液中，重復洗滌3次，通過血球計數(shù)板計算原生質體數(shù)量，4℃、200 r/min離心5 min后去掉上清，得到根系原生質體樣品用于脫落酸的提取和測定．

1．2．3 脫落酸的提取與測定 將原生質體樣品用液氮反復凍融破碎細胞;加入700μL 80%預冷的甲醇，充分混勻后，置于4℃中浸提15 h以上;4℃，16 000 r/min離心10 min后取上清;于殘渣中加入500μL 80%預冷的甲醇重復浸提2次，每次浸提4 h;離心后合并3次上清液，置于冷凍濃縮機中濃縮至干．將濃縮干的樣品溶解于20μL 10%甲醇進行LC-MS分析．

脫落酸的測定條件:(1)液相色譜條件:色譜分析柱為 Acquity UPLC? BEH C18，100 ×2．1 mm，1．7 μm;以甲醇和水梯度為流動相洗脫，起始體積分數(shù)為10%的甲醇，2 min后甲醇體積分數(shù)變?yōu)?00%;流速0．25 mL/min;柱溫35 ℃．(2)質譜條件:采用SIR測定模式;負離子;錐孔電壓30 V;毛細管電壓3．0 kV;離子源溫度120℃;脫溶劑溫度350℃;脫溶劑氣流速600 L/h;反吹氣流速50 L/h;m/z(263．2)．

2 結果與分析

通過Olympus BX51熒光顯微鏡對擬南芥葉片和根系原生質體進行觀察，發(fā)現(xiàn)經酶解游離后得到了較純凈的原生質體(圖2)．

圖2 擬南芥葉片原生質體(A)和擬南芥根系原生質體(B)Figure 2 Protoplasts of Arabidopsis leaves(A)and protoplasts of Arabidopsis roots(B)

LC-MS測得的ABA的峰型較好(圖3)，得到的ABA數(shù)據較精確．通過ABA標準品制作的標準曲線，用外標峰面積法測定得到了不同數(shù)量土培擬南芥葉片原生質體和液體MS培養(yǎng)擬南芥根系原生質體的ABA含量(圖4)及土培擬南芥葉片原生質體和液體MS培養(yǎng)擬南芥根系原生質體的ABA含量與原生質體數(shù)目之間的線性方程，相關系數(shù)分別為0．992 3，0．993 1(表 1)，線性關系較好．原生質體ABA的檢測下限由樣品中的ABA含量和檢測儀器的靈敏度決定．Waters Acquity-SQD液質聯(lián)用儀對ABA溶液的檢測下限為1．07 ng/mL．土培擬南芥葉片原生質體和MS液體培養(yǎng)擬南芥根系原生質體的ABA含量的檢測下限分別為3萬和2萬個．液體MS培養(yǎng)的擬南芥處于無菌環(huán)境下，受到高濕、水脅迫，密閉環(huán)境等影響，故其ABA含量較高．

圖3 ABA標準品(A)與樣品(B)LC-MS圖譜Figure 3 LC-MS of ABA standard(A)and sample(B)

圖4 土培擬南芥葉片原生質體(A)和水培根系原生質體(B)ABA含量與原生質體數(shù)量的線性圖Figure 4 Linear relationship between ABA content and number of protoplasts

表1 LC-MS測得的擬南芥原生質體ABA含量與原生質體數(shù)量之間的線性方程和相關系數(shù)Table 1 Linear equation and correlation coefficient between protoplasts numbers and the ABA content determined by LC-MS

3 討論與結論

本試驗通過高效液相色譜與質譜聯(lián)用，建立了提取并快速定量擬南芥根系和葉片分離的原生質體脫落酸含量的方法．通過Waters Acquity-SQD液質聯(lián)用儀測得的ABA樣品的峰型較好，所測ABA數(shù)據較精確，原生質體的ABA含量與原生質體數(shù)目之間的線性關系較好．原生質體的檢測下限主要由儀器的靈敏度和細胞中植物激素水平決定．

但利用原生質體測定植物激素也面臨著一些問題．通過原生質體測定植物激素對研究人員的操作要求較高．原生質體容易破碎，所以移取時，要選取口徑適中的移液槍槍頭，操作要輕柔．原生質體離心后要快速去上清并重新加入溶液重懸，否則原生質體容易堆積，影響原生質體的計數(shù)．在遮光條件下對原生質體進行操作，在一定程度上減少原生質體的破碎而影響試驗結果．在原生質體制備過程中植物激素降解等情況有待進一步的研究確定．

本實驗以原生質體數(shù)量代替植物組織質量對植物激素進行衡量，在統(tǒng)計方法上具有一定特色．利用原生質體測定植物激素可以減少復雜化學組份的干擾，簡化了前處理步驟，降低了誤差，從而提高植物激素測定的靈敏度和精確度．今后可在提取ABA時在樣品中加入同位素標記的ABA標準品，在試驗的每一步測定回收率，改進提取方法，以實現(xiàn)更精確的測定．

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