溫茹淑，曾德莉，方展強(qiáng)

(1．嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州514015;2．華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631)

劍尾魚(yú)(Xiphophorus helleri)，別名劍魚(yú)、青劍，英文名 Swordtail．隸屬于鳉形目，花鳉科(Poeciliidae)，胎鳉屬．原產(chǎn)地墨西哥、危地馬拉，是一種熱帶觀賞魚(yú)類，其體型小，繁殖周期短，易飼養(yǎng)．其被開(kāi)發(fā)作為水環(huán)境污染“活檢測(cè)器”的理想實(shí)驗(yàn)魚(yú)，在水生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用亦逐步展開(kāi)［1］．

關(guān)于硬骨魚(yú)類精巢組織學(xué)和形態(tài)學(xué)的研究已有較多的報(bào)道［2-3］，多集中在卵生、體外受精類型的硬骨魚(yú)類．對(duì)卵胎生、體內(nèi)受精魚(yú)類的研究則較少［3］．劍尾魚(yú)屬卵胎生，體內(nèi)受精魚(yú)類，其鰓、肝臟和腎臟的組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)已有研究報(bào)道［3-6］，尚未見(jiàn)有關(guān)其精巢組織結(jié)構(gòu)研究的報(bào)道．本研究通過(guò)對(duì)雄性劍尾魚(yú)精巢的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)等方面的研究，以期對(duì)劍尾魚(yú)的繁殖生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料，為進(jìn)一步調(diào)控魚(yú)類的生殖活動(dòng)，提高魚(yú)類的繁殖性能和生產(chǎn)水平，為劍尾魚(yú)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化提供基礎(chǔ)理論．

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用的劍尾魚(yú)(Xiphophorus helleri)于2009年6月取自珠江水產(chǎn)研究所，為同批孵化的性成熟雄性個(gè)體，體長(zhǎng)為6．35 ±0．5 cm，體質(zhì)量為1．6 ±0．6 g．

1．2 形態(tài)學(xué)觀察

將麻醉的劍尾魚(yú)置于解剖盤(pán)中，解剖觀察精巢和卵巢的外形特征，對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行描述并拍照．然后將其保存在體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．65%NaCl)中，以備觀察．

1．3 組織學(xué)觀察

活體取精巢進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，用Bouin氏液固定24 h，經(jīng)各級(jí)乙醇沖洗、脫水，經(jīng)二甲苯透明，54～56℃石蠟包埋，制成5～7μm切片，H—E染色，中性樹(shù)膠封片．置Olympus BX45-32P02顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，用尼康數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照．

1．4 超微結(jié)構(gòu)觀察

部分精巢樣品經(jīng)0．2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7．4)漂洗，投入體積分?jǐn)?shù)4%的戊二醛低溫固定15 h，后置體積分?jǐn)?shù)1%的鋨酸固定3h，逐級(jí)乙醇脫水，環(huán)氧丙烷透明，Epon812包埋，切成40～60 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾及Reynold檸檬酸鉛復(fù)染，置日立H-300型透射電鏡觀察及拍照．

2 結(jié)果與分析

2．1 精巢的外部形態(tài)

劍尾魚(yú)屬卵胎生魚(yú)類，70 d齡左右出現(xiàn)雄性性征，即尾鰭出現(xiàn)劍尾，雄魚(yú)具生殖足(由臀鰭演變而來(lái))．在解剖鏡下觀察發(fā)現(xiàn)雄性劍尾魚(yú)腹腔有劍尾魚(yú)精巢1對(duì)，約0．8 cm，呈乳白色．位于腹腔背側(cè)，消化道背面，腎臟腹面．左右精巢(T)緊密排列，呈2條索狀結(jié)構(gòu)，左右精巢前端游離于腹腔，在中部開(kāi)始匯合成1條輸精管(VD)，開(kāi)口于由臀鰭形成的生殖足．精巢其橫切面呈卵圓形，左右精巢大小略有差異，精巢外被一層結(jié)締組織膜，表面光滑，有背腹之分，背部拱起，腹部較平坦，腹面有一縱向凹陷，其中有血管分布(圖版1)．

2．2 精巢的組織結(jié)構(gòu)

劍尾魚(yú)精巢的橫切面呈卵圓形，內(nèi)部充滿了精小囊(SC)，精子發(fā)育的全過(guò)程在精小囊內(nèi)進(jìn)行(圖版2)．劍尾魚(yú)精子的發(fā)育過(guò)程歷經(jīng)初級(jí)精原細(xì)胞、次級(jí)精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、成熟精子和精子束．在同一精小囊中，精子的發(fā)育基本同步，但在不同精小囊中生殖細(xì)胞的發(fā)育不一致．生殖季節(jié)有不同發(fā)育階段生精細(xì)胞構(gòu)成的精小囊(圖版3)．在光鏡下觀察成熟雄魚(yú)的精巢切片，可見(jiàn)處于不同發(fā)育階段的精細(xì)胞．

精原細(xì)胞是生精細(xì)胞中體積最大的細(xì)胞，在精巢中可見(jiàn)到2種類型的精原細(xì)胞，包括初級(jí)精原細(xì)胞(SG1)和次級(jí)精原細(xì)胞(SG2)．

初級(jí)精原細(xì)胞 細(xì)胞體積大，緊貼生殖上皮，常1～3個(gè)分散存在，呈圓形、橢圓形或梭形，核橢圓形，居中或偏于一側(cè)，核膜清晰，細(xì)胞質(zhì)幾乎不染色，可見(jiàn)到被染成淡紅色的細(xì)胞膜(圖版4)．

次級(jí)精原細(xì)胞 靠近生殖上皮，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核圓形，核膜較初級(jí)精原細(xì)胞模糊，細(xì)胞質(zhì)染色也較淡，常幾個(gè)聚集在一起外包以極薄的結(jié)締組織膜組成一個(gè)較小的精小囊(圖版5)．

初級(jí)精母細(xì)胞 精小囊體積明顯增大，初級(jí)精母細(xì)胞(SC1)體積比初級(jí)精原細(xì)胞小，細(xì)胞呈圓形，核仁消失，細(xì)胞核圓形或橢圓形，可看見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)染色較深的染色體，核周圍間隙呈囊泡狀(圖版6)．

次級(jí)精母細(xì)胞 精小囊的體積達(dá)到最大，次級(jí)精母細(xì)胞(SC2)體積略小于初級(jí)精母細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞之間界限清楚，細(xì)胞多為圓形，細(xì)胞核位于一側(cè)，呈圓形或略橢圓形，核膜較清晰(圖版7)．

精子細(xì)胞 精子細(xì)胞(ST)小于次級(jí)精母細(xì)胞，是各期生精細(xì)胞中體積最小的生殖細(xì)胞，精子細(xì)胞中細(xì)胞核占細(xì)胞體積的絕大部分，核物質(zhì)濃縮，細(xì)胞質(zhì)減少(圖版8)．精子細(xì)胞不再分裂．它要經(jīng)過(guò)精子形成過(guò)程才能成為有功能的精子．

成熟精子 成熟精子(SP)頭部呈橢圓形，并形成細(xì)長(zhǎng)的鞭毛(圖版9)．精子鞭毛為典型的9+2結(jié)構(gòu)，中間為軸絲．

精子束 精子呈放射狀整齊排列于精小囊內(nèi)，頭部(↓)指向囊壁，尾部(↓)指向精小囊中央腔(圖版10)．

精小管內(nèi)有許多精小囊，精小囊按照精子的發(fā)育階段呈規(guī)律分布(圖版11，12)．從同一切面可看出，發(fā)育早期(↓)的細(xì)胞往往處于精巢的外圍，而發(fā)育晚期(↓)的細(xì)胞往往處于精巢的中間部位．因此可推斷，從精子發(fā)生到成熟精子的形成，精小囊是逐漸向中央腔方向移動(dòng)，在遷移過(guò)程中逐漸發(fā)育的，在精子成熟過(guò)程中，精小囊慢慢演變成包裹成熟精子的精包．最后精子以精包為單位被釋放到與輸精管相連接的輸精管中央腔(↓)中(圖版13)．待精子完全成熟后，精包破裂．精子被釋放出來(lái)，并通過(guò)輸出管排出體外．由此可說(shuō)明，劍尾魚(yú)的精巢屬于小管型精巢．

2．3 精子發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)

劍尾魚(yú)的精細(xì)胞(↓)經(jīng)過(guò)發(fā)育變態(tài)后成為形態(tài)復(fù)雜的成熟精子(圖版14)，精巢內(nèi)成熟精子呈放射狀整齊而又緊密排列于精小囊內(nèi)，頭部朝向管壁支持細(xì)胞，并埋于支持細(xì)胞中，尾部朝向精小囊中央腔，并呈多層排列(圖版15)．劍尾魚(yú)的精子分為頭部、中段、尾部3個(gè)部分，成熟精子的頭部細(xì)長(zhǎng)，呈橢圓形，只有1個(gè)由核蛋白組成染色質(zhì)致密的核，其外有1層質(zhì)膜，精子前端沒(méi)有頂體，后端有一較淺的植入窩;中段緊接精子頭部，直徑較精子頭部略大，線粒體多，其軸絲為典型的“9+2”結(jié)構(gòu)(圖版16);尾部的軸絲的橫切面也是典型的“9+2”雙聯(lián)管結(jié)構(gòu)，軸絲外包繞著線粒體鞘，外側(cè)由1層鞘膜包圍，末段軸絲裸露(圖版17)．

3 討論

3．1 劍尾魚(yú)精巢形態(tài)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)

硬骨魚(yú)類的成熟精巢體積一般較小，大多呈長(zhǎng)囊狀，且成對(duì)存在，僅件黃鱔(Monopterus albus)的除外，其精巢單一，位于身體右側(cè)，為長(zhǎng)圓柱形［7］．一般硬骨魚(yú)類的精巢在尾端合并，呈“Y”型．但一些魚(yú)類，如烏鱧(Ophicephalus argus)［8］、金色小沙丁魚(yú)(sardineUa aurita)［9］精巢在后端并不合并，而是分別開(kāi)口于泄殖腔．本文觀察到成熟劍尾魚(yú)的精巢呈2條緊密排列的索狀結(jié)構(gòu)，精巢中部匯合成一較短的輸精管，開(kāi)口于由臀鰭形成的生殖足，但精巢在外觀上并不成“Y”型．同屬于硬骨魚(yú)的褐菖鮋(Sebastiscus marmoratus)［3］、孔 雀 魚(yú) (Poecilia reticulata)［10］，其精巢分別呈梭形和腎形，在精巢的末端有左右2條輸精管平行排列，并向魚(yú)體后端延伸，最后2條輸精管匯合，經(jīng)泄殖孔開(kāi)口于體外．由此可見(jiàn)，在卵胎生魚(yú)類中，其精巢的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也存在顯著差異．而鲇形目魚(yú)類如長(zhǎng)吻鮠(Leiocassis longirostris Gianther)［2］、黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco Richardson)［10］等精巢往往分支，黃顙魚(yú)精巢每側(cè)向外伸出約26個(gè)葉狀分支，葉狀分支基部寬扁，向末端逐漸變細(xì)，貯精囊由左右側(cè)生精部在近腎臟末端處合并，形成輸精管，在輸精管兩側(cè)也伸出約14對(duì)細(xì)長(zhǎng)的指狀分支．而長(zhǎng)吻鮠［11］精巢分支更典型，精巢高度分支呈指狀，分支之上還有分支．而鲇形目的革胡子鲇(Clarias leather)等魚(yú)的精巢形態(tài)則僅精巢外側(cè)緣有少量較短的齒狀突起［12］．

圖版 劍尾魚(yú)精巢的顯微和超微結(jié)構(gòu)

3．2 劍尾魚(yú)精巢類型的劃分

關(guān)于硬骨魚(yú)類精巢類型的劃分，一般根據(jù)各級(jí)生精細(xì)胞在精巢內(nèi)分布的特點(diǎn)而分為小葉型和小管型兩種．二者的主要區(qū)別在于葉型精巢的精原細(xì)胞存在于小葉的邊緣處，隨著發(fā)育的進(jìn)行，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞形成小囊腔隙，精子細(xì)胞和精子逐漸向小囊腔的中央移動(dòng)，其成熟精子存在于小葉腔和輸精小管內(nèi)．管型精巢的精原細(xì)胞只分布在小管的盲端，隨著發(fā)育，精子細(xì)胞和精子逐漸向輸出管移動(dòng)，其成熟精子只存在于靠近輸精小管的部位．

本實(shí)驗(yàn)對(duì)劍尾魚(yú)精巢組織的研究表明，在精小管橫切面上存在一種生精細(xì)胞，并且從同一切面可看出，發(fā)育早期的細(xì)胞往往處于精巢的外圍，而發(fā)育晚期的細(xì)胞往往處于精巢的中間部位，從背側(cè)到腹側(cè)依次為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和成熟精子，從精子發(fā)生到成熟精子的形成，精小囊逐漸向中央腔方向移動(dòng)，逐漸發(fā)育，最后成熟精子被釋放到與輸精管相連接的輸精管中央腔中，并通過(guò)輸精管排出體外．故認(rèn)為劍尾魚(yú)精巢屬于管型結(jié)構(gòu)．大多數(shù)硬骨魚(yú)類的精巢為葉型精巢，屬管型精巢的魚(yú)類很少．

3．3 精子發(fā)生和形成的特點(diǎn)

劍尾魚(yú)精子的發(fā)生有如下特點(diǎn):

(1)同大多數(shù)硬骨魚(yú)類一樣，劍尾魚(yú)精巢內(nèi)存在2種類型的精原細(xì)胞，即初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞或稱之為A型精原細(xì)胞和B型精原細(xì)胞［13］．兩者的主要差異表現(xiàn)在核的形態(tài)和位置，核質(zhì)的染色程度以及細(xì)胞是否存在于精小囊中．對(duì)于魚(yú)類的精原細(xì)胞，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為有2種類型，在性成熟的雄魚(yú)精巢中初級(jí)精原細(xì)胞是一種干細(xì)胞，只能進(jìn)行有絲分裂，以維持精巢內(nèi)精原細(xì)胞數(shù)量．

(2)在初級(jí)精母細(xì)胞分裂分化成精子的過(guò)程中，細(xì)胞體積逐漸變小，核染色質(zhì)不斷地濃縮，細(xì)胞形態(tài)也由不規(guī)則變成橢圓形或者圓形，核膜質(zhì)膜由模糊逐漸變得清晰．

(3)在劍尾魚(yú)精子的形成過(guò)程中，細(xì)胞核濃縮以后鞭毛才形成，這與長(zhǎng)吻鮠的相似．

(4)在精子成熟的末期精子呈放射狀整齊排列于精小囊內(nèi)，頭部指向囊壁，尾部指向精小囊中央腔．這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在隸屬于鳉形目同為卵胎生的孔雀魚(yú)［9］和食蚊魚(yú)［11］精子發(fā)生過(guò)程中．此現(xiàn)象的生物學(xué)意義待進(jìn)一步探討．

(5)劍尾魚(yú)精子頭部細(xì)長(zhǎng)，尾部中段有發(fā)達(dá)的線粒體鞘，表明精子細(xì)微結(jié)構(gòu)是適應(yīng)卵胎生發(fā)育演化的結(jié)果，精子頭部沒(méi)有項(xiàng)體，說(shuō)明卵胎生魚(yú)類的精子是介于卵生魚(yú)類和胎生動(dòng)物之間的中間類型［9］．

3．4 體內(nèi)受精方式

研究表明，劍尾魚(yú)有交配器，生殖孔開(kāi)在臀鰭基部的前面．

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