張慶瑞,趙國棟

(1.河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 洛陽 471002；2.洛陽國家牡丹園,河南 洛陽 471011)

1 引言

牡丹(PaeoniaSuffruticosa)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)小灌木，其花型碩大、色澤艷麗、雍容華貴，自古以來，深受人們的喜愛。牡丹除了采用傳統(tǒng)的嫁接和分株方法進(jìn)行繁殖外，近年來，組織培養(yǎng)技術(shù)也取得了不小的進(jìn)展，但在牡丹組培過程中，外植體褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，嚴(yán)重影響愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代增值培養(yǎng)及根系的誘導(dǎo)[1～4]。本研究以“洛陽紅”牡丹的葉柄為外植體，通過添加不同的物質(zhì)，探索防止組織培養(yǎng)過程中葉柄褐化的方法。

2 材料與試驗(yàn)方案

2.1 材料

本實(shí)驗(yàn)以“洛陽紅”牡丹的葉柄為試驗(yàn)材料，進(jìn)行試驗(yàn)。5月份采集，修剪后經(jīng)過流水清洗，75%酒精和0.1%的升汞消毒后，切成1.5 cm的小段，從中間劈開后接種。除礦物元素濃度試驗(yàn)外，其余試驗(yàn)方案中，基本培養(yǎng)基均為1/2MS培養(yǎng)基，添加3%蔗糖、0.75%的瓊脂。除pH值試驗(yàn)外，其余培養(yǎng)基pH值均為5.8。培養(yǎng)室溫度控制在25 ℃，光照強(qiáng)度為1500～2000 Lux，光照時(shí)數(shù)每天10 h。

2.2 試驗(yàn)方案

2.2.1 不同濃度Na2SeO3對牡丹葉柄褐化的影響

在基本培養(yǎng)基內(nèi)分別加入不同濃度的Na2SeO3(0，0.01 mmol/L，0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，0.2 mmol/L)，研究分析Na2SeO3不同使用量對牡丹葉柄褐化的影響。每處理5瓶，每瓶接種9個(gè)葉柄。7 d后的觀察結(jié)果。

2.2.2 不同pH值對牡丹葉柄褐化的影響

將基本培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)成5.2、5.8、6.6、7.4、8.0，觀察外植體葉柄的褐化情況。每處理5瓶，每瓶9個(gè)葉柄。7 d后的觀察結(jié)果。

2.2.3 蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏對牡丹葉柄褐化的影響

在基本培養(yǎng)基內(nèi)，分別加入蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，觀察不同生物試劑對牡丹葉柄褐化的影響。每處理5瓶，每瓶9個(gè)葉柄。7 d后的觀察結(jié)果。

2.2.4 不同礦物元素濃度對牡丹葉柄褐化的影響

以YEB為基本培養(yǎng)基，分別添加MS培養(yǎng)基中的大量元素(除Ca)，1/2MS培養(yǎng)基中的大量元素(除Ca)，MS培養(yǎng)基中的Fe、Ca鹽，一半含量MS培養(yǎng)基中的Fe、Ca鹽，MS培養(yǎng)基中的微量元素，一半含量MS培養(yǎng)基中的微量元素。以YEB為對照，研究不同礦物元素濃度對牡丹葉柄褐化的影響。每處理5瓶，每瓶接種9個(gè)葉。7 d后的觀察結(jié)果。

2.3 褐化程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

將牡丹葉柄褐化程度分為6個(gè)等級(jí)，從重到輕依次為：5級(jí)，極嚴(yán)重褐化，整個(gè)外植體變?yōu)楹谏?級(jí)，嚴(yán)重褐化，整個(gè)外植體變?yōu)樽睾谏?級(jí)，中度褐化，外植體70%以上部分變色；2級(jí)，輕度褐化，外植體兩端變色較輕；1級(jí)，輕微褐化，基本上沒有褐化；0級(jí)，無褐化，沒有褐化。

褐化率=褐化數(shù)量÷接種數(shù)量×100%，

綜合褐化程度=(褐化等級(jí)×該等級(jí)的褐化數(shù)量+褐化等級(jí)×該等級(jí)的褐化數(shù)量……)÷褐化總數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度Na2SeO3對牡丹葉柄褐化的影響

采用不同濃度Na2SeO3處理“洛陽紅”牡丹葉柄，第3d開始出現(xiàn)褐化，7d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)。

從表1可知，Na2SeO3的防褐化效果很不理想，牡丹葉柄褐化嚴(yán)重，幾乎100%褐化，且隨著Na2SeO3使用濃度的增加，綜合褐化程度呈加重趨勢。因此，Na2SeO3顯然沒有達(dá)到控制牡丹葉柄褐化的理想效果。

表1 不同濃度Na2SeO3對牡丹葉柄褐化的影響

3.2 不同pH值對牡丹葉柄褐化的影響

不同pH值對牡丹葉柄褐化的影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，當(dāng)pH=5.2時(shí)，褐化率最低，隨著pH值的升高，褐化率升高，在pH=7.4時(shí)，褐化率達(dá)到了100%，但總體褐化程度降到最低。

表2 不同pH值對牡丹葉柄褐化的影響

3.3 蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏對牡丹葉柄褐化的影響

表3為蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏對牡丹葉柄褐化的影響結(jié)果。由表3可知，無論添加哪種生物試劑，控制褐化的效果都不理想，不僅出現(xiàn)了100%褐化，褐化程度亦非常嚴(yán)重，所以這三種生物試劑對抑制牡丹葉柄褐化作用不明顯。

表3 生物試劑對牡丹葉柄褐化的影響

3.4 不同礦質(zhì)元素對牡丹葉柄褐化的影響

由表4可以看出，無論添加MS培養(yǎng)基中的哪種成分，與對照相比，各處理的褐化均顯著加重，褐化率也較高。添加1/2MS大量元素(無鈣)、MS大量元素(無鈣)、1/2的MS Ca鹽Fe鹽、MS的Ca鹽Fe鹽等組合褐化率均達(dá)到100%，褐化程度方面，添加Ca鹽Fe鹽的組合均顯著高于添加大量元素的組合。添加MS微量元素(無鐵)組合的荷花率為90.7%，褐化程度顯著低于添加添加Ca鹽Fe鹽組合和添加大量元素的組合，顯著高于添加1/2的MS微量元素(無鐵)。

表4 不同礦質(zhì)元素濃度對牡丹葉柄褐化的影響

4 結(jié)論與討論

某些植物材料在組織培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生水解型多酚，這類外植體在培養(yǎng)過程中其培養(yǎng)基的顏色會(huì)變深，原因是多酚類物質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，之后被氧化為醌類物質(zhì)，而這些多酚類物質(zhì)和醌類物質(zhì)會(huì)抑制多種酶的活性，使得外植體對營養(yǎng)物質(zhì)的主動(dòng)吸收和轉(zhuǎn)化受到阻礙[5]。本實(shí)驗(yàn)預(yù)通過添加Na2SeO3、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏等影響酚類化合物與酶結(jié)合，從而避免醌類物質(zhì)的出現(xiàn)，阻止褐化的產(chǎn)生。但試驗(yàn)結(jié)果表明：該4種藥品并沒有起到有效的控制褐化的效果，對該研究沒有實(shí)際意義。

成功的經(jīng)驗(yàn)表明，選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w并建立最佳的培養(yǎng)條件是克服材料褐化的最主要手段[6]。在牡丹葉柄組織培養(yǎng)的防褐化研究中，綜合考慮褐化率及總體褐化程度，在牡丹葉柄組培中，應(yīng)選用pH=5.2的培養(yǎng)基。一般認(rèn)為，無機(jī)鹽成分為組織培養(yǎng)眾多的因子中較為重要的因素[7]?；趯Σ煌V質(zhì)元素濃度對牡丹葉柄褐化影響的研究，在確保礦質(zhì)營養(yǎng)元素充足的情況下，降低礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量有利于控制褐化。