王秋菊，任雨龍，魏 笑，張 昊，孫 愉，高炳南 (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

在反芻動(dòng)物的養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂導(dǎo)致的生產(chǎn)性能下降等問(wèn)題[1]。因此，如何能夠在保證經(jīng)濟(jì)效益的前提下，安全高效的解決養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題，提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能，成為了很多學(xué)者頗為關(guān)注的內(nèi)容[2]。

按照學(xué)科領(lǐng)域的劃分，外植體有以下兩個(gè)定義。在細(xì)胞生物學(xué)中，外植體是指：在植物組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)中，作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織片段[3];而在生態(tài)學(xué)中將其定義為：把一些生物體移植到人工控制條件下，以觀測(cè)它們?cè)诃h(huán)境變化時(shí)的反應(yīng)，此生物體即為外植體[4]。本文主要就生態(tài)學(xué)定義的有關(guān)反芻動(dòng)物外植體的研究進(jìn)行綜述，希望能夠?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝的研究提供新的思路和幫助。

1 外植體在試驗(yàn)研究中的應(yīng)用

近年來(lái)，反芻動(dòng)物一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱門對(duì)象。但多數(shù)反芻動(dòng)物的價(jià)格昂貴，樣本采集困難，而外植體能夠代替活體動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的某些反應(yīng)機(jī)制，并且成本低、易采集，成為了很多學(xué)者的優(yōu)先選擇[5-7]。然而，由于反芻動(dòng)物外植體培養(yǎng)技術(shù)出現(xiàn)的時(shí)間較晚，部分外植體的培養(yǎng)體系尚不完善，國(guó)內(nèi)外有關(guān)外植體培養(yǎng)的報(bào)道還比較少。

目前，反芻動(dòng)物外植體的研究對(duì)象主要集中于牛，羊等家畜[8-9]，奶牛，綿羊的子宮內(nèi)膜，腸道以及綿羊的瘤胃外植體已經(jīng)被用于試驗(yàn)研究。可能是由于反芻動(dòng)物獨(dú)特的消化方式，這些研究主要以細(xì)菌或其代謝衍生物與外植體之間的相互作用為切入點(diǎn)開(kāi)展試驗(yàn)[10]。

和反芻動(dòng)物外植體相關(guān)的研究不斷取得新的成果，發(fā)現(xiàn)的共同點(diǎn)是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體會(huì)出現(xiàn)活性逐漸降低，直至完全喪失的現(xiàn)象。而通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分以及配比，可以延緩?fù)庵搀w活性的喪失時(shí)間。

1.1 瘤胃外植體的應(yīng)用反芻動(dòng)物的瘤胃主要分為3層，由腔內(nèi)層到外層依次是黏膜層，黏膜肌層和漿膜層。黏膜層即為瘤胃上皮，分布著大量的角質(zhì)化乳頭。瘤胃外植體保留的是瘤胃上皮，它能夠通過(guò)上調(diào)動(dòng)物體內(nèi)與酮體代謝、角蛋白纖維錨定、細(xì)菌識(shí)別和皮膚屏障等生物學(xué)功能有關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)化出更強(qiáng)的酮體代謝和調(diào)控微生物定植的能力[11]。

有研究通過(guò)分離培養(yǎng)綿羊的瘤胃外植體，檢測(cè)釀酒酵母β-葡聚糖對(duì)綿羊瘤胃外植體中β-防御素-1及其mRNA的影響，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖能夠有效的促進(jìn)綿羊瘤胃外植體內(nèi)β-防御素-1的表達(dá)，證實(shí)瘤胃外植體比單層瘤胃上皮細(xì)胞更能夠保留與機(jī)體相似的組織學(xué)特征[12]。FATHI等[13]通過(guò)體外模擬綿羊瘤胃模型，首次發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素在離體的瘤胃節(jié)段模型中上調(diào)，認(rèn)為瘤胃外植體模型是評(píng)估細(xì)菌脂多糖對(duì)綿羊瘤胃外植體影響的合適工具。而瘤胃外植體在培養(yǎng)24 h后，會(huì)出現(xiàn)輕微的上皮細(xì)胞層脫落，這種現(xiàn)象主要與培養(yǎng)方法，供體動(dòng)物和分離部位有關(guān)，而24 h也被認(rèn)為是綿羊瘤胃外植體最佳的培養(yǎng)時(shí)間[9]。

1.2 腸道外植體的應(yīng)用腸道保護(hù)屏障主要包括黏膜屏障，生物屏障，免疫屏障，機(jī)械屏障。任何一個(gè)屏障遭到破壞都會(huì)影響動(dòng)物的生理健康狀況，而腸道屏障功能的維持主要依靠黏膜免疫系統(tǒng)和腸道菌群之間的相互作用[14]。目前，反芻動(dòng)物腸道免疫與腸道菌群的研究受限于動(dòng)物品種、養(yǎng)殖環(huán)境和不同生長(zhǎng)階段的養(yǎng)殖模式等因素[15]。腸道外植體可以反映腸內(nèi)膜在黏附中的作用。ADRIAN等[16]將eaeA基因插入到滅活的大腸桿菌中，進(jìn)行犢牛腸道外植體黏附試驗(yàn)，證實(shí)了腸道外植體內(nèi)膜的缺失與大腸桿菌的黏附程度無(wú)關(guān)。FRANCIS等[17]明確了大腸桿菌在牛的結(jié)腸，回腸和直腸外植體上的定植、附著和消退的病變變化。此外，有研究用細(xì)菌激活劑刺激大腸外植體，明確TNF-α，IL-1RA等細(xì)胞因子在大腸外植體內(nèi)的釋放機(jī)制，證明腸道外植體可以反映機(jī)體對(duì)外界刺激產(chǎn)生免疫的機(jī)制[18]。腸道外植體在研究菌群調(diào)控動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫物質(zhì)活性和增強(qiáng)抗炎細(xì)胞因子表達(dá)等方面，起著十分重要的導(dǎo)向作用。

1.3 子宮內(nèi)膜外植體的應(yīng)用子宮內(nèi)膜和機(jī)體中大多數(shù)黏膜一樣，是病原菌侵入機(jī)體時(shí)第一道發(fā)揮作用的防線[19]。它對(duì)病原體的免疫反應(yīng)體系包括補(bǔ)體系統(tǒng)、抗菌肽、免疫球蛋白、急性期蛋白和模式識(shí)別受體[20]。細(xì)菌感染通常通過(guò)先天免疫途徑引起牛子宮內(nèi)膜炎和不孕。然而，直接使用細(xì)胞進(jìn)行的機(jī)制研究可能會(huì)因?yàn)樽訉m內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的破壞，以及相關(guān)分子模式的損傷而受影響，所以完整的子宮內(nèi)膜外植體模型是研究反芻動(dòng)物先天免疫和炎癥較好的體外模型[21]。有研究建立了完整的子宮內(nèi)膜體外模型，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜外植體對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌或其識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)都存在功能性的先天免疫應(yīng)答，該技術(shù)為免疫機(jī)制的體內(nèi)觀察研究以及體外研究提供一個(gè)有效的途徑[22]。LI等[23]從奶牛子宮內(nèi)膜黏膜層中分離出含上皮和間質(zhì)組織的內(nèi)膜組織，明確了β-雌二醇對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜外植體中前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)功能發(fā)揮的影響，發(fā)現(xiàn)外植體培養(yǎng)的條件越接近動(dòng)物體內(nèi)的生理環(huán)境，外植體存活時(shí)間也會(huì)越長(zhǎng)。MIYNARCZUK等[24]在添加不同劑量的農(nóng)藥后發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度低于100 μg/L的農(nóng)藥對(duì)牛絨毛膜外植體的活性不會(huì)產(chǎn)生影響，證實(shí)了犢牛絨毛膜外植體存在著與體內(nèi)相似的反應(yīng)機(jī)制。此外，牛子宮內(nèi)膜外植體可以間接反映LPS對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖能力和形態(tài)損傷的影響[25]。

2 外植體模型的構(gòu)建方法

外植體的采集和培養(yǎng)方法需要根據(jù)組織的來(lái)源以及具體的試驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。無(wú)論是瘤胃外植體，腸道外植體還是子宮內(nèi)膜外植體，在采取時(shí)要求整個(gè)過(guò)程無(wú)菌操作，且組織要完整，為了減緩組織活性的喪失，用含有雙抗的PBS緩沖液沖洗掉雜物后，通常在37℃條件下置于含雙抗的PBS緩沖液中暫存[26]。

瘤胃外植體需要分離瘤胃組織的漿膜層和黏膜肌層，保留黏膜層，再將黏膜層剪切成4 mm2大小，瘤胃乳頭朝上放置于6孔培養(yǎng)板中。在37℃、5% CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，使用DMEM/F12培養(yǎng)基即可滿足營(yíng)養(yǎng)需要[27]。在培養(yǎng)基中不添加胎牛血清可能更有利于瘤胃外植體的存活以及形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持[28]。

腸道外植體的分離方法與瘤胃外植體十分相似，需要保留腸道組織的上皮部分，棄去其他部分。用無(wú)菌的PBS緩沖液多次沖洗后，使用DMEM培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，并補(bǔ)充氯霉素，氨芐西林或者四環(huán)素，使之終質(zhì)量濃度分別為10，100，30 mg/L。在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)6 h后收取樣品[29]。也有研究將腸道外植體剪切成12 mm2，置于RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)[30-31]。

在分離子宮內(nèi)膜時(shí)，用70%的酒精先沖洗子宮外表面，沖洗干凈后使用無(wú)菌剪刀縱向打開(kāi)子宮角，再用含抗生素的PBS(50 IU/mL青霉素，50 mg/L鏈霉素，2.5 mg/L兩性霉素B)沖洗暴露的子宮內(nèi)膜，然后使用無(wú)菌剪刀分離出大約2 mm厚的半透明子宮內(nèi)膜。將之轉(zhuǎn)移到6孔組織培養(yǎng)板中，添加3 mL含有10%滅活胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基。在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，每24 h或者更短的時(shí)間更換1次培養(yǎng)基[22]。培養(yǎng)期間根據(jù)具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行不同的處理,在外植體培養(yǎng)時(shí)，需要讓組織與空氣充分接觸，使細(xì)胞能夠更好的吸收氧氣，同時(shí)還要防止組織代謝產(chǎn)物造成的培養(yǎng)基過(guò)度酸化，導(dǎo)致外植體的存活時(shí)間縮短[23]。

總之，培養(yǎng)外植體使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM，RPMI 1640、DMEM/F12等可基本滿足營(yíng)養(yǎng)需要，至于是否添加胎牛血清以及添加血清的含量還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，在不同的研究中使用抗生素的種類和含量也存在一些差異。而目前有關(guān)不同培養(yǎng)基以及抗生素對(duì)外植體培養(yǎng)效果差異的研究報(bào)道較少。因此，在構(gòu)建外植體模型時(shí)，具體的培養(yǎng)方法還需要根據(jù)試驗(yàn)的目的和要求進(jìn)行細(xì)節(jié)上的變動(dòng)和完善。

3 外植體活性的評(píng)價(jià)方法

3.1 細(xì)胞角蛋白-18細(xì)胞角蛋白(cytokerati，CK)通常在上皮細(xì)胞中可以檢測(cè)到，它與上皮細(xì)胞的種類，增殖和分化聯(lián)系密切，常用來(lái)評(píng)價(jià)上皮組織的完整性以及上皮細(xì)胞分化程度[32]。CK有20種，是最大的中間絲蛋白家族成員。在這些CK中，細(xì)胞角蛋白-18(cytokerati-18，CK-18)在構(gòu)成細(xì)胞骨架，維持機(jī)體組織結(jié)構(gòu)的完整性中發(fā)揮著十分重要的作用。

在不同的細(xì)胞分化階段和不同種類的上皮細(xì)胞中，CK的表達(dá)也是不同的。Ⅰ型CK呈酸性，Ⅱ型CK呈中性或堿性[33]。而CK-18根據(jù)酸堿性分類屬于Ⅰ型CK，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，CK-18會(huì)被端粒酶特異性裂解[34]。利用CK-18的這種特性可以鑒別培養(yǎng)組織中的細(xì)胞是發(fā)生凋亡還是發(fā)生壞死，即死亡細(xì)胞釋放CK-18如果為端粒酶裂解，則為細(xì)胞凋亡。如果是非裂解形式，則為細(xì)胞壞死[35]。

通過(guò)檢測(cè)CK-18的M65片段與M30片段濃度的比值也可以判斷培養(yǎng)組織細(xì)胞的死亡形式[36]。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，CK-18會(huì)被半胱天冬酶切割，產(chǎn)生的片段會(huì)釋放到細(xì)胞外，這些裂解的片段會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，細(xì)胞外的 CK-18 濃度間接反映了凋亡細(xì)胞的數(shù)量，CK-18的M65與M30 2個(gè)片段可作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物[37]。

3.2 抗原Ki-67抗原Ki-67(antigen Ki-67，Ki-67)是一種核蛋白，其基因主要由15個(gè)外顯子與14個(gè)內(nèi)含子組成[38]。它與細(xì)胞內(nèi)核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄緊密相關(guān)，在細(xì)胞增殖過(guò)程中的各個(gè)周期(G1期，S期，G2期和M期)中都能夠表達(dá)，只有在細(xì)胞靜止時(shí)期(G0期)不表達(dá)[39]。由于Ki-67在細(xì)胞增殖時(shí)期表現(xiàn)較為活躍，而在細(xì)胞停止增殖時(shí)則會(huì)消失，所以通常稱之為細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，可作為細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志反應(yīng)細(xì)胞的增值活躍程度，Ki-67蛋白表達(dá)越高，則說(shuō)明細(xì)胞增殖的活性越強(qiáng)[40]。此外，Ki-67具有顯示細(xì)胞生長(zhǎng)活性的特性，利用這種特性判斷細(xì)胞的增殖活性具有比較高的靈敏度，常用來(lái)評(píng)估細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)[41]。從根本上來(lái)看，外植體是諸多組織細(xì)胞緊密連接的一個(gè)整體，細(xì)胞的活性也可以反映整個(gè)外植體的活性。因此，Ki-67作為評(píng)價(jià)外植體活性的指標(biāo)具有較高的靈敏度以及準(zhǔn)確性。

3.3 E-鈣黏附蛋白E-鈣黏附蛋白(epithelia cadherin，E-cadherin)是黏附蛋白家族中十分重要的一類單鏈跨膜蛋白，參與機(jī)體細(xì)胞與細(xì)胞間黏附的生理過(guò)程。根據(jù)鈣黏附蛋白的分子結(jié)構(gòu)以及基因序列可以將其分為經(jīng)典鈣黏附蛋白、橋粒鈣黏附蛋白、原始鈣黏附蛋白以及其他的一些鈣黏附蛋白相關(guān)蛋白[42]。在反芻動(dòng)物機(jī)體中，它廣泛分布于各類組織的上皮細(xì)胞中，在維持組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整以及抑制細(xì)胞之間的離散等方面起著十分重要的作用[43]。E-cadherin在動(dòng)物組織中的表達(dá)量逐漸下降時(shí)，則表明組織中的細(xì)胞黏附能力由強(qiáng)向弱轉(zhuǎn)變，細(xì)胞也比較容易從組織中脫落下來(lái)，組織的活性也會(huì)隨之降低[44]。

3.4 蘇木精-伊紅染色蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，即HE染色，是觀察組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性的常用方法。一般動(dòng)物外植體正常的生理變化或者是添加某些刺激物之后的形態(tài)變化，都可以通過(guò)HE染色方法觀察出來(lái)，這主要是培養(yǎng)組織中的不同成分對(duì)染液的親和力不同造成的[45]。HE染色的切片在經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚碇?，組織中的細(xì)胞核會(huì)呈現(xiàn)出十分清晰的深藍(lán)色區(qū)域，而細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分則會(huì)呈現(xiàn)出深淺不一的粉紅色，從而能夠?qū)⒏鞣N組織或細(xì)胞成分的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)顯現(xiàn)出來(lái)[46]。

3.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒與噻唑藍(lán)法細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)和噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)法是較為普遍的檢測(cè)動(dòng)物外植體和細(xì)胞活性方法。CCK-8法與MTT法相比有更多的優(yōu)點(diǎn)，不但能夠減少外植體在空氣中的暴露時(shí)間，降低活性損失，而且CCK-8法檢測(cè)動(dòng)物外植體活性的靈敏度也優(yōu)于MTT法，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)外植體細(xì)胞的毒性很低，外植體細(xì)胞形態(tài)基本上不會(huì)發(fā)生變化，而MTT法會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)完全消失。在外植體的培養(yǎng)過(guò)程中，分離的樣本量是十分多的，所以CCK-8法更加適合動(dòng)物外植體活性的檢測(cè)[47]。除了CCK-8和MTT方法外，還有一些比較方便快捷的檢測(cè)方法，比如XTT鈉鹽(XTT sodium salt，XTT)法，水溶性四唑鹽-1(WST-1)法等。

4 外植體存在的問(wèn)題與展望

4.1 外植體存在的問(wèn)題

4.1.1培養(yǎng)存活時(shí)間短 外植體的存活時(shí)間主要與培養(yǎng)方法、供體動(dòng)物和分離部位有關(guān)[18]。存活時(shí)間短的特點(diǎn)也決定了外植體模型僅僅適用于一些試驗(yàn)周期短的研究。而通過(guò)進(jìn)一步豐富培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠延長(zhǎng)牛子宮內(nèi)膜外植體上皮細(xì)胞和外周基質(zhì)細(xì)胞的生存時(shí)間至48 h[26]。因此，如何進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，延長(zhǎng)外植體存活時(shí)間，是外植體培養(yǎng)技術(shù)面臨的主要問(wèn)題。

4.1.2組織采取技術(shù)要求高 大多數(shù)外植體模型的采集都是通過(guò)用器械對(duì)組織物理切割獲得的，對(duì)采集的手法和準(zhǔn)確度有較高的要求。在采集動(dòng)物子宮內(nèi)膜時(shí)，需要用手術(shù)剪剪開(kāi)子宮角中間的側(cè)壁部分，再將子宮內(nèi)膜從子宮肌層上揭下來(lái)，這個(gè)過(guò)程中很有可能會(huì)出現(xiàn)子宮內(nèi)膜破損等情況[28]。

4.1.3組織處理精確度低，誤差大 當(dāng)試驗(yàn)有較多的分組或?qū)M織塊大小有要求時(shí)，這個(gè)問(wèn)題是無(wú)法避免的。目前并沒(méi)有特定的器材能夠準(zhǔn)確而快速的將組織處理成相同的大小。利用普通的手術(shù)器械操作誤差較大，很難保證每個(gè)分組中組織的大小相同，會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)較大的影響[48]。

4.2 展望近年來(lái)，諸多學(xué)者從試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，解決問(wèn)題，對(duì)外植體存活時(shí)間短，組織處理操作困難等問(wèn)題進(jìn)行了積極的探索[9-13]。進(jìn)一步改進(jìn)了外植體的培養(yǎng)技術(shù)方案，對(duì)外植體培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展起到了極大的推動(dòng)作用，促進(jìn)了反芻動(dòng)物外植體培養(yǎng)技術(shù)的完善與進(jìn)步。但由于諸多外植體培養(yǎng)技術(shù)存在一些差異，尤其是環(huán)境條件，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和生長(zhǎng)因子等方面，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果會(huì)造成不同程度的影響，導(dǎo)致外植體培養(yǎng)技術(shù)的使用范圍仍具有一定的局限性[49-51]。因此，我們需要根據(jù)外植體的來(lái)源以及試驗(yàn)?zāi)康牡纫蛩?，整合各個(gè)培養(yǎng)方案中的優(yōu)點(diǎn)，建立一個(gè)有針對(duì)性的、系統(tǒng)的、標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)方案。

隨著新研究的不斷進(jìn)行，反芻動(dòng)物外植體培養(yǎng)技術(shù)也會(huì)日趨完善。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用和普及有利于充分發(fā)揮外植體的優(yōu)勢(shì)，降低試驗(yàn)成本，豐富研究?jī)?nèi)容，為反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝，黏膜免疫機(jī)制，感染預(yù)防以及治療等方向的研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。在生產(chǎn)實(shí)踐方面，也能為解決養(yǎng)殖生產(chǎn)中存在的問(wèn)題提供一定的理論幫助。