王英 趙亞清 高洪泉 繆智輝 葉子堅(jiān)

本文旨在探討從人臍帶靜脈血是否可分離出基質(zhì)干細(xì)胞，如果可以，確定它們的特性，方法是采用不支持造血干細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血單個(gè)核細(xì)胞，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 12份臍血采至廈門(mén)市中山醫(yī)院，每份30～60ml。

1.2 基質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)經(jīng)新生兒父母同意，于廈門(mén)市中山醫(yī)院采集正常足月新生兒臍帶血12份，用L-DMEM培養(yǎng)液懸浮制備好的細(xì)胞，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到70%匯合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察與生長(zhǎng)曲線繪制 每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與增殖情況，拍照。對(duì)于臍血貼壁采用連續(xù)照相計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目21～30 d，描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 貼壁細(xì)胞鑒定 取第2代的臍帶血基質(zhì)干細(xì)胞，PBS液沖洗3遍，用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液消化后，1000 r/min離心10 min，用PBS沖洗，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml，接種在放置有蓋玻片的24孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，取出蓋玻片，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，而后按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，分為4份，分別滴加兔抗鼠 CD34、CD44、CD49 d、CD106一抗。1∶100稀釋，加入50 ul于蓋玻片上，放入濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，隔天用PBS沖洗3次后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗50 ul，1∶200稀釋，37℃作用2 h后，用PBS洗滌3次，用SABC顯色試劑盒顯色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 臍血貼壁細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果 12份臍血于細(xì)胞培養(yǎng)后48h在倒置顯微鏡下觀察全部可見(jiàn)散在的單個(gè)貼壁細(xì)胞，數(shù)量較少，體積較其他細(xì)胞大，呈短梭形、針形或三角形，細(xì)胞邊界折光性強(qiáng)。其中有6份臍血貼壁細(xì)胞增殖迅速，第5d時(shí)貼壁細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)，形成20～50個(gè)細(xì)胞的集落，并能維持成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖1)，以后細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)增加，其中2例14～21 d細(xì)胞達(dá)80%匯合，4例30 d達(dá)70%匯合。而另外6份臍血貼壁細(xì)胞增殖緩慢，以大圓形或橢圓形細(xì)胞為主，長(zhǎng)梭形細(xì)胞較少，以后細(xì)胞體積逐漸增大，形態(tài)由梭形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌蕡A形或橢圓形，10 d后細(xì)胞邊界變清晰，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，21 d以后細(xì)胞未能達(dá)到匯合，并趨向死亡。細(xì)胞傳代后可見(jiàn)生長(zhǎng)停滯，細(xì)胞體積逐漸增大，形狀有梭形變?yōu)閳A形或橢圓形，后期細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞崩解死亡。

2.2 生長(zhǎng)曲線 由圖2可見(jiàn)臍血基質(zhì)細(xì)胞原代細(xì)胞生長(zhǎng)情況，1～3d增殖較慢，5d后細(xì)胞增殖加速，2周后速度又減慢，細(xì)胞平均倍增時(shí)間為42 h。

2.3 貼壁細(xì)胞鑒定 對(duì)第2代貼壁細(xì)胞通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)了CD44、CD106四個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記，結(jié)果顯示貼壁細(xì)胞CD44陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色(圖3);而CD106為陰性表達(dá)，大部分細(xì)胞胞漿未著色，細(xì)胞核藍(lán)染(圖4)。說(shuō)明貼壁細(xì)胞為臍帶血基質(zhì)干細(xì)胞。

圖1 5d時(shí)細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng)(200×)

圖2 臍血基質(zhì)細(xì)胞原代生長(zhǎng)曲線

圖3 CD44陽(yáng)性染色(×200)

圖4 CD106陰性染色(×200)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在L-DMEM培養(yǎng)液中加入一定量的bFGF，12份臍血中有6份長(zhǎng)成均質(zhì)性的纖維樣細(xì)胞，成功率較Erice[1]的有所提高?？稍谝欢ǔ潭壬咸岣吣氀?xì)胞生長(zhǎng)與增殖。

本實(shí)驗(yàn)中從臍帶血獲取的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞表面表達(dá)CD44陽(yáng)性;而CD106為陰性表達(dá)。有以上結(jié)論說(shuō)明已經(jīng)得到純度較高的臍帶血基質(zhì)干細(xì)胞。

[1]Erices A，Conget P，Minguell JJ.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.Brit J Haematol，2000，109:235-242．