趙雅寧， 李建民，劉 樂， 常學(xué)優(yōu)， 陳長香， 李淑杏， 張 盼

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是不依賴于死亡受體途徑和線粒體途徑的一條新的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑。已證實(shí)缺血、缺氧、能量匱乏等損傷因素可啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［1，2］;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過整合細(xì)胞核、線粒體、高爾基復(fù)合體等亞細(xì)胞器反應(yīng)，以決定細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸:恢復(fù)、修復(fù)、損傷、加重或死亡。糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated proteins 78，GPR78)和 CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP))是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的兩個(gè)經(jīng)典標(biāo)志物。高血壓并發(fā)腦梗死后細(xì)胞胞低氧、氧自由基、ATP耗竭、鈣穩(wěn)態(tài)及炎癥反應(yīng)等各種因素加重［3～5］，這些因素通過直接或間接地途徑引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。JNK(CJunNH2-terminalkinases)稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated MAP kinases，SAPK)，被認(rèn)為是介導(dǎo)細(xì)胞損傷的重要通路，近年來的研究顯示JNK信號的激活與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。SP600125為JNK特異性抑制劑，可以特異性阻斷JNK信號通路活化，抑制神經(jīng)細(xì)胞的死亡。但SP600125對高血壓腦缺血再灌注后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否有影響，未見相關(guān)報(bào)道。本研究分別應(yīng)用血壓正常大鼠和高血壓大鼠復(fù)制全腦缺血再灌注模型，應(yīng)用SP600125進(jìn)行干預(yù)，觀察對CHOP和 GPR78的表達(dá)的影響，初步探討SP600125對高血壓全腦缺血模型大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)是目前國際公認(rèn)的接近人類原發(fā)性高血壓病的動(dòng)物模型，出生后5周齡SHR大鼠血壓開始逐漸升高，10周齡可達(dá)180mmHg［6］;Wistar-Kyoto(WKY)大鼠是與自發(fā)性高血壓大鼠相匹配的同源正常血壓大鼠，為SHR的正常血壓對照組動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)共用12周齡健康雄性WKY大鼠60只，60只同周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。抑制劑SP600125購自 Cell Signaling公司;多克隆 CHOP、GPR78抗體和內(nèi)參β-actin購自Santa Cruz公司(美國);多克隆磷酸化JNK和CHOP、GPR78免疫組化試劑盒購自中杉生物有限公司(北京)。

1.2 動(dòng)物分組和模型制備 60只雄性WKY大鼠隨機(jī)分為血壓正常假手術(shù)組和血壓正常全腦缺血再灌注組;另取60只雄性自發(fā)性高血壓大鼠分為高血壓全腦缺血再灌注組和JNK特異性抑制劑SP600125干預(yù)組。每組又隨機(jī)平均分為缺血再灌注6h、24h和48h時(shí)間亞組，各時(shí)間點(diǎn)入組動(dòng)物10只。分別取WKY大鼠和SHR大鼠，采用改良的Pulsineli 4 血管阻斷(4-VO)法［12，13］制作大鼠全腦缺血模型:動(dòng)物在水合氯醛麻醉下(350mg/kg)，切開動(dòng)物頸正中，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，在其下置線備用;切開大鼠枕后部正中，暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼孔，直視下熱凝其下通過的椎動(dòng)脈，電凝每次時(shí)間約2～4s，以翼小孔周圍骨質(zhì)變白為標(biāo)準(zhǔn)，使翼小孔后雙側(cè)椎動(dòng)脈永久閉塞。術(shù)后大鼠縫皮回籠，24h后以無創(chuàng)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血30min后松開動(dòng)脈夾，實(shí)行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測溫儀監(jiān)測耳內(nèi)鼓膜溫度，并使之維持在37℃±0.2℃。應(yīng)用HE染色觀察海馬區(qū)出現(xiàn)明顯的壞死神經(jīng)細(xì)胞為判斷標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組:動(dòng)物只進(jìn)行麻醉，離暴露血管等處理，但不電凝椎動(dòng)脈、不夾閉頸總動(dòng)脈。SP600125干預(yù)組術(shù)前30min側(cè)腦室注射SP600125 10μl，藥物在 5min內(nèi)注完，留針 2min，其余操作同全腦缺血再灌注組。

1.3 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察(蘇木伊紅染色)各組動(dòng)物在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)取5只動(dòng)物，以戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，用40g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定后取腦，后固定24h梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，片厚5μm。切片二經(jīng)甲苯脫蠟，梯度乙醇降至水，蘇木精-伊紅染色。每只鼠連續(xù)3張冠狀背側(cè)海馬切片，在有測微尺的光學(xué)顯微鏡(400×)下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化并計(jì)數(shù)該視野下的存活神經(jīng)元數(shù)量(有明顯細(xì)胞膜、細(xì)胞核、核仁為存活神經(jīng)細(xì)胞)。具體方法:將CA1區(qū)平均分為3個(gè)等份，每個(gè)等份選取一個(gè)相同部位，計(jì)數(shù)其中每個(gè)視野(200×)下存活神經(jīng)元數(shù)量，以每個(gè)視野下平均細(xì)胞數(shù)量表示。

1.4 CHOP、GPR78免疫組化檢測 切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復(fù)，分別滴加磷酸化JNK抗體(1∶150)、CHOP抗體(1∶200)和 GPR78抗體(1∶200)，濕盒中4℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV二步法)，37℃溫箱30min，DAB顯色，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片，陽性率的定量分析:鏡下觀察并攝片，陽性率的定量分析:每個(gè)標(biāo)本取4張切片，將每張切片的CA1區(qū)平均分為3個(gè)等份，每個(gè)等份選取一個(gè)相同部位的4個(gè)視野，在有測微尺的光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)其中每個(gè)視野(400×)陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。以每個(gè)視野下平均陽性細(xì)胞數(shù)量表示。

1.5 CHOP、GPR78免疫印跡法測定 大鼠致死后，迅速取雙側(cè)海馬區(qū)組織，稱量0.6g，4℃PBS充分洗滌，加入3倍體積的4℃全細(xì)胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心5min，12000r/min，取上清。考馬斯亮藍(lán)法測各樣本的蛋白含量，樣本貯存于-80℃?zhèn)溆谩z測步驟:蛋白樣品40μg與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10min，100g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫下震蕩2～3h，加入抗體(CHOP和 GPR78均為 1∶2000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h，TBST洗膜，ECL顯色，用圖像分析儀測定光密度，作定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，檢驗(yàn)方法為組間分析采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，組內(nèi)分析采用SNK-q分析。數(shù)據(jù)以均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P ＜0.05為有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 SP600125對高血壓腦缺血海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失的影響 各組海馬區(qū)存活神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量(見表1)。血壓正常腦缺血再灌注組各時(shí)間死亡細(xì)胞增多，死亡神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞輪廓模糊，排列紊亂，胞體收縮呈多角形或不規(guī)則，部分胞質(zhì)自溶，各時(shí)間點(diǎn)存活神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少;高血壓全腦缺血再灌注組中海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷加重，大部分胞質(zhì)自溶，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞存活密度進(jìn)一步降低，表明高血壓可增加腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞丟失;SP600125干預(yù)組海馬區(qū)神經(jīng)元部分結(jié)構(gòu)完整，存活的神經(jīng)元較缺血組明顯增多。

2.2 SP600125對高血壓腦缺血再灌注對CHOP、GPR78陽性細(xì)胞數(shù)量及表達(dá)的影響 免疫組化法檢測CHOP、GPR78陽性細(xì)胞數(shù)量(見表2、表3)。與血壓正常假手術(shù)組比較，血壓正常腦缺血再灌注組6h、24和48h時(shí)間點(diǎn)，GPR78陽性細(xì)胞增多，24h達(dá)高峰;與血壓正常腦缺血再灌注組比較，高血壓全腦缺血再灌注組中GPR78陽性細(xì)胞6h增多，24和48h時(shí)間點(diǎn)減少;與高血壓全腦缺血再灌注組比較，SP600125干預(yù)組中各時(shí)間點(diǎn)GPR78陽性細(xì)胞明顯增多;CHOP:與血壓正常假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注組6h、24h和48h時(shí)間點(diǎn)CHOP陽性細(xì)胞均增多，24h達(dá)高峰，高峰持續(xù)至48h;與血壓正常腦缺血再灌注組比較，高血壓全腦缺血再灌注組中6h、24h時(shí)間CHOP增多，48h減少;與高血壓全腦缺血再灌注組比較，SP600125干預(yù)組中各時(shí)間點(diǎn)CHOP陽性細(xì)胞減少。

免疫印跡法檢測CHOP、GPR78蛋白表達(dá)水平:以β-actin校準(zhǔn)后的蛋白條帶IOD值反映其磷酸化水平。結(jié)果顯示(見表4、表5)。與血壓正常假手術(shù)組比較，血壓正常腦缺血再灌注組中 CHOP、GPR78蛋白水平在各時(shí)間時(shí)間點(diǎn)明顯上調(diào)，其中GPR78 24h達(dá)高峰，CHOP高表達(dá)持續(xù)至48h;與血壓正常腦缺血再灌注組比較，高血壓全腦缺血再灌注組中GPR78蛋白水平6h增多，24和48h時(shí)間點(diǎn)減少;CHOP 6和24h表達(dá)增多，48h表達(dá)減少;與高血壓全腦缺血再灌注組比較，SP600125干預(yù)組中GPR78蛋白水平上調(diào)，CHOP在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)下降。

表1 各組大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量比較(個(gè)/HP n=15，)

表1 各組大鼠海馬區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)量比較(個(gè)/HP n=15，)

與血壓正常假手術(shù)組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術(shù)組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組26.65 ±4.36 20.86 ± 4.74*13.22 ±3.12#16.90 ±3.30△26.78 ± 4.40 17.81 ±4.36*10.68 ±2.18#14.26 ±3.00△27.28 ±4.60 15.12 ±2.64*8.86 ± 2.06#11.78 ±2.36△

表2 各組大鼠海馬區(qū)GPR78陽性細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/HP n=15，)

表2 各組大鼠海馬區(qū)GPR78陽性細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/HP n=15，)

與血壓正常假手術(shù)組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較，△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術(shù)組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組2.25 ±0.70 8.21 ±1.12*12.44 ±1.64#15.96 ±1.86△2.32 ±0.68 18.67 ±1.44*8.22 ±1.64#14.10 ±1.63△2.40 ±0.75 12.64 ±1.16*6.20 ±1.21#11.05 ±1.57△

表3 各組大鼠海馬區(qū)CHOP陽性細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/HP n=15，)

表3 各組大鼠海馬區(qū)CHOP陽性細(xì)胞數(shù)量比較(個(gè)/HP n=15，)

與血壓正常假手術(shù)組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較，△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術(shù)組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組0.85 ±0.30 8.63 ±1.12*16.58 ±1.30#9.63 ±1.21△0.78 ±0.28 21.47 ±1.66*27.16 ±1.44#19.16 ±2.22△0.80 ±0.30 19.56 ±1.57*17.36 ±1.33#15.02 ±1.22△

表4 各組大鼠海馬區(qū)GPR78蛋白水平比較比較(n=15，)

表4 各組大鼠海馬區(qū)GPR78蛋白水平比較比較(n=15，)

與血壓正常假手術(shù)組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術(shù)組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組0.043 ±0.021 0.132 ±0.034*0.162 ±0.024#0.188 ±0.036△0.052 ±0.020 0.183 ±0.034*0.130 ±0.018#0.159 ±0.021△0.047 ±0.018 0.158 ±0.026*0.115 ±0.014#0.140 ±0.020△

表5 各組大鼠海馬區(qū)CHOP蛋白水平比較(n=15，)

表5 各組大鼠海馬區(qū)CHOP蛋白水平比較(n=15，)

與血壓正常假手術(shù)組比較*P＜0.05;與血壓正常腦缺血組比較#P＜0.05;與高血壓腦缺血組比較△P＜0.05

組別6h 24h 48h血壓正常假手術(shù)組血壓正常腦缺血組高血壓腦缺血組SP600125組0.048 ±0.008 0.110 ±0.014*0.145 ±0.021#0.128 ±0.016△0.050 ±0.009 0.136 ±0.020*0.242 ±0.038#0.190 ±0.032△0.049 ±0.010 0.179 ±0.016*0.158 ±0.022#0.126 ±0.017△

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯合成和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的儲(chǔ)存場所。有害性刺激可打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重要的分子伴侶，參與蛋白質(zhì)折疊修飾，并可以作為鈣結(jié)合蛋白維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中增多的GRP78使錯(cuò)誤折疊蛋白正確折疊后，結(jié)合并抑制蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇酶l(IRE1)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)，對細(xì)胞起到保護(hù)作用［7，8］。CHOP 正常情況下表達(dá)很低。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，PERK和IRE-1活化均能對CHOP產(chǎn)生誘導(dǎo)，CHOP過度表達(dá)則使細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的凋亡更敏感［9］。本研究發(fā)現(xiàn)高血壓腦缺血組海馬區(qū)GRP78表達(dá)下降，CHOP表達(dá)增加，而存活神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，提示高血壓通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的GRP78和CHOP異常表達(dá)加重腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞丟失。

本研究發(fā)現(xiàn)SP600125預(yù)處理可顯著增加高血壓腦缺血后GRP78表達(dá)、下調(diào)CHOP表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活，提示SP600125可通過減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮對高血壓全腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。SP600125是JNK信號特異性的抑制劑，其藥理作用包括:可逆性地競爭ATP從而抑制JNK;呈劑量相關(guān)性地抑制c-Jun的磷酸化和炎性因子環(huán)氧化酶-2、白細(xì)胞介素-2、免疫反應(yīng)性纖維結(jié)合腫瘤壞死因子-α 表達(dá);抑制氧自由基的生成［10，11］。此外 JNK信號與多種通路如ERK通路、AKT通路存之間存在“網(wǎng)絡(luò)對話”。有研究顯示，抑制JNK信號通路，AKT通路活性增高;上調(diào)AKT活性，可上調(diào)GRP78表達(dá)，緩解缺血再灌注導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激狀態(tài)［12，13］。因此推測SP600125可通過降低炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的失衡，或是通過“網(wǎng)絡(luò)對話”機(jī)制，使保護(hù)性信號通路活性增高，從而調(diào)節(jié)GRP78、CHOP表達(dá)水平，穩(wěn)定細(xì)胞ER功能，增強(qiáng)細(xì)胞對高血壓加重腦缺血再灌注的耐受能力，促進(jìn)神經(jīng)元的存活。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SP600125可調(diào)控高血壓全腦缺血大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的GRP78、CHOP表達(dá)，對神經(jīng)有保護(hù)作用。在高血壓腦梗死的治療和預(yù)防中，是否可以JNK信號為切入點(diǎn)，調(diào)整GRP78、CHOP的表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的平衡，以延緩和減少神經(jīng)元的進(jìn)一步丟失是我們需注意的關(guān)鍵問題。

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