戴巧定 宋欣偉 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006康海英 杭州市余杭區(qū)第五人民醫(yī)院

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性多關(guān)節(jié)腫痛為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的自身免疫性疾病。確切病因及發(fā)病機(jī)制迄今不明，其基本病理特征為滑膜炎，細(xì)胞因子在滑膜病變中起核心作用，其中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-a，TNF-α）和白介素（interleukin-1β，IL-1β）均是RA發(fā)病機(jī)制中居中心地位的促炎細(xì)胞因子[1]。有研究顯示[2-5]，RA患者在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)方面有諸多異常改變，與多種神經(jīng)肽有關(guān)，其中P物質(zhì)（substance P，SP）是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在炎癥、疼痛的發(fā)生機(jī)制中都占有重要的地位，對關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有重要促進(jìn)作用。雷公藤（Tripterygium wilfordii．Hook）治療RA療效肯定，具有緩解癥狀和改善病情的雙重作用[6]。本研究應(yīng)用佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，予雷公藤多苷灌胃治療，觀察大鼠血液、關(guān)節(jié)滑膜等外周組織以及中樞脊髓后角的SP水平的變化，初步探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康Wistar雄性大鼠，體重150±10g，清潔級，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。1.2 試劑與儀器 不完全弗氏佐劑：Sigma公司；凍干注射用滅毒卡介苗（BCG）：上海生物制品研究所；P物質(zhì)放免試劑盒：北京華英生物技術(shù)研究所；TNF-α、IL-1β放免試劑盒：北京北方生物技術(shù)研究所；SN－695型智能放免r測量儀：上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠；GC-911-r-放射免疫技術(shù)儀：中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司；雷公藤多苷片，上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠，批號060603，規(guī)格10mg/片，臨用前用蒸餾水配成0.5mg/mL混懸液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立 造模組大鼠右側(cè)后肢足跖部皮內(nèi)注射0.1 mL完全弗氏佐劑，正常組注射0.1mL生理鹽水。致炎前，用電子天平測量大鼠體質(zhì)量，用足趾容積測量儀測量每只大鼠右后足(標(biāo)記線以下)的足容積（mL3），作為模型前的足基礎(chǔ)容積，代表造模前情況。致炎后15天，再次稱重、測量大鼠兩側(cè)腳掌的體積，并根據(jù)成功評判指標(biāo)[7]判斷造模是否成功，并剔除造模不成功者。

2.2 分組及給藥 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、雷公藤組，各10只。造模成功（致炎后15天）后開始給藥，雷公藤組給予雷公藤多苷片，每鼠每次給藥2 mL，每天灌胃2次；正常及模型組每鼠每次給蒸餾水2 mL，每天灌胃2次，共30天。

2.3 觀察指標(biāo)與標(biāo)本采集 致炎前用足趾容積測量儀首先測量并記錄各組大鼠右后足的足容積（mL3），致炎后密切觀察足跖腫脹情況，并分別于致炎后1、15、30、45天測量各組大鼠體質(zhì)量及右后足的足容積（mL3），同時(shí)觀察治療藥物對大鼠足跖腫脹的影響。給藥30天后取各組大鼠的靜脈血，離心后提取血漿，剩余全血離心后提取血清，均置于－20℃保存?zhèn)溆?；同時(shí)迅速取出AA大鼠脊髓腰段及L3～5對后根神經(jīng)節(jié)，經(jīng)液氮凍存后，用打孔法取出脊髓后角，經(jīng)4℃低溫離心機(jī)4 000 r/min離心10 min后，提取上清液并－70℃密封保存，備測；制備大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜并提取上清液，－70℃保存?zhèn)錂z。

2.4 標(biāo)本放射免疫法測定 嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，將制備好的血漿、血清、脊髓上清液、滑膜上清液分別進(jìn)行P物質(zhì)、TNF-α、IL-1β測定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠右足跖腫脹程度 致炎后第1、15天，模型組大鼠右足跖與正常組比較腫脹明顯（P＜0.05）；雷公藤組予灌胃治療30天后，與模型組比較，右足跖腫脹明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠右足跖腫脹程度比較（±s）mL3

表1 各組大鼠右足跖腫脹程度比較（±s）mL3

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

15天1.12±0.02 1.87±0.06*1.91±0.13*組 別正常組模型組雷公藤多苷組n/只10 10 10 0天1天1.05±0.05 1.05±0.06 1.04±0.06 1.06±0.08 2.07±0.12*2.04±0.17*30天1.20±0.15 1.80±0.07*1.70±0.11*△45天1.30±0.02 1.68±0.07*1.50±0.08*△

3.2 各組大鼠體質(zhì)量變化 致炎后大鼠體質(zhì)量較正常大鼠增長明顯緩慢，予雷公藤多苷干預(yù)后，體質(zhì)量增加較模型組快，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s）g

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（±s）g

注：與正常組比較，*P＜0.05

15天200.00±9.32 174.40±6.80*170.00±6.20*組 別正常組模型組雷公藤多苷組n/只10 10 10 1天162.12±2.78 159.31±1.03 151.20±3.62 30天266.25±7.54 190.40±9.55*196.80±7.56*45天302.00±8.04 209.20±5.11*221.80±7.56*

3.3 各組大鼠SP水平比較 造模成功后，模型組大鼠脊髓后角、血漿和滑膜中的SP水平均明顯高于正常組（P＜0.05）；藥物干預(yù)后，與模型組比較，雷公藤組大鼠血漿、滑膜SP水平降低（P＜0.05），其中滑膜SP水平接近正常組水平（P＞0.05），但脊髓后角SP水平在治療30天后無明顯下降（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠血漿組織SP含量比較（±s）pg/mL

表3 各組大鼠血漿組織SP含量比較（±s）pg/mL

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別正常組模型組雷公藤多苷組n/只10 10 10脊髓后角15.76±6.76 24.76±2.87*24.17±11.23*血漿26.45±11.26 65.58±24.45*43.48±14.78*△滑膜134.72±13.32 209.86±13.75*132.86±43.49△

3.4 各組大鼠TNF-α、IL-1β水平比較 與正常組比較，造模成功后，模型組大鼠血清、滑膜中的TNF-α、IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）；給藥后，與模型組比較，雷公藤組大鼠血清、滑膜中TNF-α水平及滑膜中 IL-1β 都顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠血清組織TNF-α、IL-1β水平比較（±s）pg/mL

表4 各組大鼠血清組織TNF-α、IL-1β水平比較（±s）pg/mL

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

TNF-α血清 滑膜0.53±0.21 0.66±3.63*0.68±3.87*組 別正常組模型組雷公藤多苷組n/只10 10 10 7.80±5.16 9.98±1.38*7.93±4.54△49.27±5.98 177.71±86.06*120.50±43.56*△IL-1β血清 滑膜30.60±16.90 54.71±18.57*31.08±7.80△

4 討論

目前認(rèn)為，多基因和環(huán)境因素共同誘發(fā)RA病理性自身免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致RA表現(xiàn)以破壞性多關(guān)節(jié)炎和不同的關(guān)節(jié)外炎癥病變，其中細(xì)胞因子在其病變中具有重要作用，TNF-α、IL-1β均是RA發(fā)病機(jī)制中居中心地位的促炎癥細(xì)胞因子。在RA患者血液及炎性滑液中均可檢測出高濃度的TNF-α和IL-1β，并與關(guān)節(jié)炎活動程度相一致，應(yīng)用TNF-α單克隆抗體以及IL-1受體拮抗劑可以明顯改善RA患者的病情[8]。

SP是最早發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，屬于哺乳動物速激肽家族，在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。SP對傷害性感受器及炎癥有初級的始動作用，即周圍神經(jīng)末梢由于組織損傷或炎癥時(shí)釋放的化學(xué)介質(zhì)變得敏感，釋放SP。SP作用于T、B淋巴細(xì)胞膜上的SP受體，能增強(qiáng)T細(xì)胞增殖功能，調(diào)節(jié)B細(xì)胞合成免疫球蛋白，促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺及5-羥色胺，促進(jìn)各種細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重炎癥。SP也是一種舒血管物質(zhì)，能增強(qiáng)血管通透性，導(dǎo)致血漿滲出和水腫，因此在關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)下，關(guān)節(jié)局部SP濃度上升可導(dǎo)致毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增加，出現(xiàn)紅腫的臨床表現(xiàn)[9]。Lotz等[10-11]等對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，顯示SP能使類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜組織增生，刺激膠原酶、前列腺素E2釋放，后兩者又增加了RA滑膜細(xì)胞增殖，且這種作用可被SP拮抗劑抑制，提示神經(jīng)末梢釋放的SP可以直接參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理過程。這表明SP在關(guān)節(jié)炎的血管翳形成、軟骨與骨破壞中起重要作用。并有最新研究顯示[3]，依那西普（TNF-α抑制劑）治療RA患者11例，血清中SP水平明顯下降。

SP既是炎癥介質(zhì)，同時(shí)又是一種疼痛遞質(zhì)，處于致痛機(jī)制中的中心地位，在脊髓背角膠質(zhì)區(qū)富含SP傳入纖維末梢，持續(xù)電、熱、化學(xué)等外周傷害性刺激可引起傳入纖維末梢SP釋放，脊髓背角的SP明顯增多。傅開元等[12]發(fā)現(xiàn)疼痛性顳下頜關(guān)節(jié)紊亂綜合征（TMJDS）患者關(guān)節(jié)液SP含量明顯高于無痛性TMJDS。SP能傳導(dǎo)及易化初級傷害性刺激，還能促進(jìn)另一種疼痛介質(zhì)前列腺素E2的分泌，激活依靠前列腺素的感受傷害途徑，這可能是關(guān)節(jié)疼痛傳遞的機(jī)制之一。SP還可刺激肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組織胺等非神經(jīng)源性疼痛介質(zhì)而致痛。另外，SP誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子具有明顯的誘導(dǎo)痛覺過敏的作用。SP的這些作用均促進(jìn)疼痛的產(chǎn)生，加重疼痛反應(yīng)[13]。

雷公藤為衛(wèi)茅科植物，研究表明，雷公藤具有抗炎、免疫抑制及抗增殖等作用，廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、腎小球腎炎、皮膚病、腫瘤等多種疾病的治療，療效肯定。雷公藤治療RA的細(xì)胞與分子生物學(xué)主要機(jī)制：通過抑制細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性減少炎癥部位炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等水平，減少炎癥反應(yīng)；通過誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和滑膜細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生免疫抑制和抑制血管翳增殖作用，達(dá)到控制RA活動進(jìn)展的目的[6]。臨床發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷既具有抗炎免疫抑制作用，又有鎮(zhèn)痛作用。李振軍等[14]認(rèn)為，中樞SP與免疫功能有關(guān)，提示雷公藤多苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療可能是通過提高中樞SP含量抑制免疫。本研究結(jié)果顯示，SP在AA大鼠的外周及中樞組織中高表達(dá)，與TNF-α、IL-1β的水平相一致，提示SP在RA的炎癥及疼痛過程中起重要作用，與以往研究結(jié)果一致。雷公藤多苷治療后，關(guān)節(jié)腫脹改善，其作用途徑可能通過抑制血液及滑膜中的SP、TNF-α和IL-1β水平而起到抗炎免疫抑制及鎮(zhèn)痛作用，且對滑膜的影響大于血液，但對中樞SP水平無影響，可能與用藥劑量、作用時(shí)間或樣本量等多種因素有關(guān)。同時(shí)SP作為疼痛介質(zhì)，中樞SP是否與疼痛關(guān)系更為密切，非甾體消炎藥的治療能否降低其水平，尚有待于進(jìn)一步研究。

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