王曉蕾 時(shí)藝珊 柏 松 (沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110002)

2007年中國糖尿病患者人數(shù)已達(dá)3980萬，預(yù)計(jì)2025年將達(dá)到5930萬〔1〕。對(duì)糖尿病易患因素及其發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)引起學(xué)者們的極大關(guān)注。吸煙是導(dǎo)致人群多種疾病發(fā)生和死亡的重要影響因素。研究表明，吸煙與糖尿病(尤其2型糖尿病)及其并發(fā)癥的發(fā)病有明確關(guān)系〔2〕。本研究通過觀察吸煙的2型糖尿病大鼠腎臟組織中期因子(midkine，MK)的表達(dá)情況，分析吸煙對(duì)糖尿病腎病發(fā)病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 取60只Wistar大鼠(購自中國醫(yī)科大學(xué))，8周齡，雄性，清潔級(jí)。體重130～200 g。去除體重差異較大的大鼠，隨機(jī)分配為三組。①正常對(duì)照組20只。②2型糖尿病非吸煙組20只。③2型糖尿病吸煙組20只。

1.1.2 主要設(shè)備及試劑 鏈脲佐菌素(streptoztocin，STZ，美國Sigma公司);顆粒飼料(購自中國醫(yī)科大學(xué));高糖高脂飼料(自配);香煙為市售X牌香煙，尼古丁含量1 mg/支，焦油含量18 mg/支。RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及RT－PCR試劑盒(美國Ambion公司)。按GenBank合成引物。日立7170全自動(dòng)生化儀(日本日立公司);PCR儀(德國Biometra公司);Chemi Imager 5500凝膠圖像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 ①確定胰島素抵抗動(dòng)物模型:三組大鼠均每籠3～4只，飼養(yǎng)7 w，室溫21℃ ～26℃，濕度 50% ～60%，12 h光照周期，動(dòng)物室內(nèi)每天清掃消毒。正常對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)，2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。飲水為純凈水。三組7 w時(shí)測(cè)空腹血糖及胰島素，確定胰島素抵抗動(dòng)物模型。②小劑量STZ靜脈注射誘導(dǎo)2型糖尿病模型〔3〕:2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組大鼠尾靜脈注射STZ 15 mg/kg(以pH4.5的0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液配成0.3%濃度)，對(duì)照組僅注射枸櫞酸鈉緩沖液。三組繼續(xù)原飼料喂養(yǎng)1 w后測(cè)空腹血糖及胰島素。確定2型糖尿病動(dòng)物模型。③將2型糖尿病吸煙組大鼠20只關(guān)進(jìn)自制“被動(dòng)吸煙箱”內(nèi)。吸煙箱上方有通風(fēng)口與外界相通，側(cè)壁有與香煙直徑相通的孔，保證香煙煙霧由側(cè)壁孔可逐漸擴(kuò)散至整個(gè)吸煙箱內(nèi)。大鼠在此環(huán)境中“吸煙”，頻率設(shè)定為每天吸煙2次，每?jī)纱伍g隔4 h，每次30 min。2型糖尿病非吸煙組及對(duì)照組大鼠同時(shí)也被關(guān)進(jìn)其他“吸煙箱”相同時(shí)間，不輸入香煙煙霧。4 w后檢測(cè)三組空腹血糖、空腹胰島素及尿白蛋白水平。

1.2.2 空腹血糖、胰島素及尿白蛋白測(cè)定 第0周、第7周、第8周、第12周各測(cè)一次空腹血糖、空腹血清胰島素水平(禁食水12 h后尾靜脈采血)。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖(mmol/L)×空腹血清胰島素(mU/L)/22.5〔4〕。第0周、第7周、第8周、第12周各測(cè)一次尿白蛋白。

1.2.3 PCR法檢測(cè)MK的基因表達(dá) 實(shí)驗(yàn)12 w時(shí)三組大鼠均處死，取腎臟組織冷凍保存。應(yīng)用RNA提取液提取總RNA。按試劑盒說明合成cDNA。設(shè)計(jì)MK正向和反向引物:上游5′－CCTGCAACTGGAAGAAGGAG－3′，下游 5′－CTTTGGCCTTTGACTTGGTC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為 189 bp。內(nèi)參照 β－actin 引物序列上游 5′－GGGAAATCGTGCGTGACAT－3′，下游 5′－GTTCTAGTAACCAGGAGGACT－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為 385 bp。RT－PCR反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增條件為94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s;循環(huán)35個(gè)周期，72℃延伸3 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察，拍照。應(yīng)用密度系統(tǒng)分析電泳帶的密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)資料以±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 第12周時(shí)各指標(biāo)比較 2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組空腹血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)均明顯高于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);2型糖尿病吸煙組各指標(biāo)也明顯高于2型糖尿病非吸煙組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組尿白蛋白定量明顯高于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);2型糖尿病吸煙組尿白蛋白定量也明顯高于2型糖尿病非吸煙組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 第12周時(shí)三組空腹血糖、胰島素及尿白蛋白比較(±s)

表1 第12周時(shí)三組空腹血糖、胰島素及尿白蛋白比較(±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與2型糖尿病非吸煙組比較:2)P＜0.05

組別 n 空腹血糖(mmol/L) 空腹胰島素(mU/L) 胰島素抵抗指數(shù) 尿白蛋白(μg/dl)20 5.03±0.03 9.44±1.34 2.25±0.08 57.31±5.842型糖尿病非吸煙組 20 9.22±0.041) 21.13±2.171) 8.04±0.281) 284.25±19.731)2型糖尿病吸煙組 20 11.01±0.111)2) 25.65±3.531)2) 12.53±1.561)2) 791.37±9.951)2)正常對(duì)照組

2.2 第12周時(shí)三組大鼠腎臟組織PCR法檢測(cè)MK表達(dá) 2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組MK表達(dá)均明顯低于對(duì)照組。2型糖尿病非吸煙組MK表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)4.5倍，2型糖尿病吸煙組較對(duì)照組下調(diào)10.7倍，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且與三組尿白蛋白水平呈顯著負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為－0.813，P ＜0.01)。見圖1。

1:Marker;2:對(duì)照組;3:2型糖尿病非吸煙組;4:2型糖尿病吸煙組

3 討論

世界范圍內(nèi)，吸煙是人類的一個(gè)重要死亡原因〔5〕。吸煙與腫瘤、心腦血管疾病、高血脂、糖尿病等疾病發(fā)病均有重要關(guān)系〔6～8〕。流行病學(xué)調(diào)查顯示，戒煙成功可降低人群死亡率，但既往吸煙史帶來的不良影響仍會(huì)持續(xù)數(shù)年，糖尿病患者表現(xiàn)更為明顯〔9，10〕。

吸煙通過多種機(jī)制影響糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，包括胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激等〔11，12〕。吸煙對(duì)腎臟的損傷主要包括影響腎臟及全身血流動(dòng)力學(xué)、影響水和電解質(zhì)排泄、影響近曲小管功能、影響血小板及內(nèi)皮素的功能等〔13〕。本研究通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)及靜脈注射STZ誘導(dǎo)方法成功制備出2型糖尿病大鼠模型，并通過測(cè)量尿白蛋白定量確定糖尿病腎病。研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)12 w時(shí)2型糖尿病非吸煙組大鼠的尿蛋白定量明顯高于對(duì)照組，吸煙2型糖尿病大鼠的尿蛋白定量明顯高于2型糖尿病非吸煙組和對(duì)照組，說明吸煙確實(shí)能夠促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，與其相關(guān)的基因主要包括:與糖、脂代謝相關(guān)的基因、與高血壓血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)的基因、與胰島素敏感性相關(guān)的基因、與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因等。其中腎素－血管緊張素相關(guān)基因長(zhǎng)期引起人們的關(guān)注。MK是一種典型的分泌蛋白，其基因主要在腎臟表達(dá)，與多效營養(yǎng)因子共同組成肝素營養(yǎng)因子家族。MK在不同種屬間高度保守，人的MK基因位于染色體11q11.2，介于二酰甘油Z基因和毒蕈樣乙酰膽堿受體4基因之間〔14〕。人和鼠MK氨基酸序列有87%同源性。研究發(fā)現(xiàn)，MK在神經(jīng)生長(zhǎng)、血管生成、腫瘤發(fā)生、組織修復(fù)等方面具有豐富的生物學(xué)功能，近年來研究發(fā)現(xiàn)MK參與腎素－血管緊張素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，通過抑制腎素－血管緊張素系統(tǒng)活性對(duì)腎臟起到保護(hù)作用〔15～18〕。本研究中第12周時(shí)取三組大鼠腎臟組織，PCR法檢測(cè)MK表達(dá)。2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組MK表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，而2型糖尿病吸煙組較2型糖尿病非吸煙組MK表達(dá)減低更加明顯，與尿白蛋白定量存在相關(guān)性，說明腎臟組織中MK的表達(dá)下降與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)且吸煙加重了這種作用機(jī)制。吸煙可能通過減低腎臟組織中MK的表達(dá)水平進(jìn)而影響腎素－血管緊張素系統(tǒng)活性，促進(jìn)2型糖尿病腎病的進(jìn)展。已有研究發(fā)現(xiàn)，MK可通過蛋白激酶C通路、磷脂酰激醇－3激酶通路及有絲分裂原活化蛋白激酶通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用，也可直接作用于細(xì)胞而發(fā)揮作用〔17，19〕。下一步研究應(yīng)關(guān)注MK對(duì)糖尿病腎病作用的具體機(jī)制，為臨床治療提供思路，以及進(jìn)一步探究吸煙對(duì)糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。

通過本研究得出結(jié)論，MK在2型糖尿病腎病的發(fā)病中發(fā)揮作用，吸煙可以通過降低MK的表達(dá)進(jìn)一步加重糖尿病腎病的發(fā)展。因此，積極倡導(dǎo)廣泛戒煙，養(yǎng)成良好生活方式，對(duì)早期預(yù)防2型糖尿病腎病發(fā)生具有積極意義。

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